雙孢蘑菇雜交菌株As2796家系的分子遺傳研究

王澤生　廖劍華　陳美元　曾偉　宋思揚(yáng)　

摘　要：應(yīng)用PCR和凝膠電泳等技術(shù)，對(duì)雙孢蘑菇雜交菌株As2796及其親本和子代作分子遺傳標(biāo)記跟蹤分析，結(jié)果如下:1)總DNA的RAPD分析表明，隨著遺傳代數(shù)的增加，雜種子代和出發(fā)異核體親本間的遺傳差異逐漸增大;2)mtDNA的酶切圖譜表明，親本8213及其雜交子代具有相同的基因型，表明雙孢蘑菇的mtDNA呈單親遺傳;3)Est同工酶的PAGE圖譜表明，結(jié)合了親本02高產(chǎn)特征和8213優(yōu)質(zhì)特征的雜交子代具有兩個(gè)親本的標(biāo)記帶型，證明Est同工酶標(biāo)記是雙孢蘑菇新菌株特性預(yù)測(cè)或鑒定的有效指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：雙孢蘑菇，家系，分子遺傳，RAPD，線粒體DNA，酯酶同工酶

分類號(hào)：Q939.96　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-3515（2001）02-0233-0237

MOLECULAR GENETIC STUDY ON THE PEDIGREE OF HYBRID STRAIN AS2796 OF AGARICUS BISPORUS

WANG Ze-Sheng（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）　

LIAO Jian-Hua（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）　

CHEN Mei-Yuan（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）　

ZENG Wei（Fujian Research Institute of Light Industry， Fuzhou 350005）　

ZENG Wei（Department of Biology， Xiamen University， Xiamen 361005）　

SONG Si-Yang（Department of Biology， Xiamen University， Xiamen 361005）　

1 前言

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange(Imbach)]是世界性研究、生產(chǎn)和消費(fèi)的食用真菌。自從荷蘭育種家G.Fritsche首先于1981年育成商業(yè)雜交菌株U1和U3(Fritsche, 1983)并由Darmycel菌種公司投放市場(chǎng)以來(lái),雜交菌株已經(jīng)基本取代了傳統(tǒng)的孢子分離菌株。在中國(guó)，福建省輕工業(yè)研究所于1983年開始雙孢蘑菇的雜交育種研究,1986年以來(lái)建立起同工酶預(yù)測(cè)、鑒定新菌株等雜交育種技術(shù)(王澤生等,1989,1990,1991),先后選育出As376、As1671和As2796等系列雜交菌株,其中As2796明顯結(jié)合了雙親本高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)的特征,成為中國(guó)最廣泛使用的商業(yè)菌株,年產(chǎn)鮮菇超過(guò)30萬(wàn)噸(王澤生等,1995)。雜交菌株的育成和應(yīng)用無(wú)疑使雙孢蘑菇的生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益都得到顯著的提高,但是對(duì)雙孢蘑菇雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)理研究甚少。在使用多年以后，某些雜交菌株表現(xiàn)出對(duì)溫度敏感或?qū)喼γ共∏秩久舾?子實(shí)體叢生等現(xiàn)象,導(dǎo)致產(chǎn)、質(zhì)量下降等退化表現(xiàn)。那么這些退化現(xiàn)象的分子機(jī)理又如何呢?鑒于此,我們認(rèn)為有必要對(duì)雜交菌株的家系進(jìn)行遺傳跟蹤分析,以便進(jìn)一步探討雙孢蘑菇雜交優(yōu)勢(shì)形成與退化的遺傳基礎(chǔ),用于指導(dǎo)進(jìn)一步的雜交育種和菌種保藏,預(yù)測(cè)新菌株可能形成的優(yōu)良性狀,監(jiān)測(cè)新菌株在長(zhǎng)期保藏后與生產(chǎn)使用中的性狀表現(xiàn),直接服務(wù)于生產(chǎn)。

此前，F(xiàn)ritsche于1987年發(fā)現(xiàn)U1菌株發(fā)生凹頂、空腹、硬開傘和單產(chǎn)下降等退化現(xiàn)象。為了復(fù)壯U1菌株,她采用原生質(zhì)體克隆,多孢分離培養(yǎng),單孢分離培養(yǎng),并用原先的2個(gè)同核體重復(fù)雜交,發(fā)現(xiàn)U1的F2代單孢分離株表現(xiàn)出較大的變異性(1991)。 Khush等(1992)用RAPD技術(shù)作了雙孢蘑菇遺傳親子的分析,Kerrigan等(1993)通過(guò)系統(tǒng)家系的構(gòu)建,以DNA分子標(biāo)記為輔助,分析標(biāo)記在親本及其子代中的分離情況,建立了雙孢蘑菇遺傳連鎖圖。本研究應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD),線粒體DNA(mtDNA)酶切電泳和酯酶(Est)同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)分析雜交菌株As2796的遺傳家系。

2 材料與方法

2.1菌株

雙孢蘑菇菌株02,8213,361-2,As165,W95-2,As2796和As4607由福建省輕工業(yè)研究所,

福建省蘑菇菌種研究推廣站提供,它們的遺傳關(guān)系如圖1所示。

單孢分離

02────→361-2┐雜交 單孢分離 單孢分離

單孢分離 ├──→W95-2────→As2796────→As4607

8213────→As165┘

P Ps F1 F2 F3

異核親本 同核不育株 雜交子一代 雜交子二代 雜交子三代

圖1 雙孢蘑菇雜交菌株As2796的遺傳家系

Fig.1 The genetic family of hybrid As2796 of Agaricus bisporus

2.2 總DNA的RAPD分析

菌絲培養(yǎng),總DNA提取,RAPD分析方法及所用試劑基本同前(曾偉等,1999),并參考朱衡等(1994),Khush等(1992)的方法。所用隨機(jī)引物編號(hào)及核苷酸序列如表1。

表1 隨機(jī)引物的商品編號(hào)及DNA序列

Table1 Commercial number and DNA sequences of Random Primers

編號(hào)

Number

引物序列(5’→3’)

Sequence of Primers

編號(hào)

Number

引物序列(5’→3’)

Sequence of Primers

OPU01

ACGGACGTCA

OPU16

CTGCGCTGGA

OPU03

CTATGCCGAC

OPU17

ACCTGGGGAG

OPU06

ACCTTTGCGG

OPU18

GAGGTCCACA

OPU12

TCACCAGCCA

OPU19

GTCAGTGCGG

OPU15

ACGGGCCAGT

2.3 mtDNA的酶切分析

2.3.1 試劑:RNaseA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、CfoI、MspI、TaqI購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司，BamHI、EcoRI、Tris堿、飽和酚購(gòu)自加拿大Sangon公司。其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.3.2 菌絲培養(yǎng):各菌株接在PDA液體培養(yǎng)基上，24℃靜置培養(yǎng)15-30天。

2.3.3 mtDNA提取:參照廖劍華等人的方法(2000)。用兩層紗布過(guò)濾液體PDA培養(yǎng)的菌絲體，加蒸餾水洗一遍，盡量擠干水分。稱重后，按12ml緩沖液/10g菌絲體的比例加入預(yù)冷的BufferA(1.0M蔗糖，0.01m KH2PO4，0.1%BSA，2mM半胱氨酸，1mMEDTA，pH7.2 )，在高速組織搗碎機(jī)中充分破碎，1700g 4℃離心20min，上清用兩層紗布過(guò)濾后，15000g 4℃離心20min，用20ml BufferB(0.6M蔗糖，10mM Tris-Cl，pH7.5，2mM EDTA)洗滌一遍，15000g 4℃離心20min，沉淀加2ml BufferC(10mMTris-Cl，pH8.0，10mM EDTA，100mM NaCl，2%N-十二烷基肌氨酸鈉) 混勻，加RNase至0.5mg/ml，30℃水浴30min，酚，氯仿/異戊醇各抽提一遍，加0.1V 3M NaAc，2V無(wú)水乙醇-20℃沉淀2hr，臺(tái)式離心機(jī)收集沉淀，70%乙醇洗后吹干，溶于適量純水中, -20℃保存?zhèn)溆谩?p> 2.3.4 酶切:用廠家提供的緩沖液，50ul體系，適量DNA和內(nèi)切酶，適宜溫度下酶解2.5hr，加EDTA至10mM終止反應(yīng)。

2.3.5 電泳:按Sambrook等的方法。檢測(cè)提取的DNA樣品用0.8%瓊脂糖，檢測(cè)酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖，電壓5V/cm。EB染色照相。

2.4 Est同工酶的PAGE分析

菌絲培養(yǎng)、Est同工酶樣品提取、PAGE方法及所用試劑均同前(王賢樵等,1989a,b)。

3.結(jié)果與分析

3.1 RAPD分析

本實(shí)驗(yàn)用9種隨機(jī)引物對(duì)雙孢蘑菇As2796家系的7個(gè)菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,均得到陽(yáng)性結(jié)果,將得到的所有電泳圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果列于表2。聚類分析各菌株間的遺傳相似值,根據(jù)公式(Nei等,1979):相似值S=2Nab/Na+Nb對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,換算出各菌株間的遺傳相似值,并列于家系遺傳構(gòu)成圖中(圖2)。

表2 以02和8213為出發(fā)親本的遺傳家系中的各菌株間Nab/Na+Nb統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表

Table 2 Statistical data of Nab/Na+Nb between strains of the genetic family with parental strains 02 and 8213

Number

02

361-2

8213

As165

W95-2

2796

4607

02

361-2

33/98

8213

31/97

31/107

As165

21/79

25/89

25/89

W95-2

27/87

28/98

35/96

20/78

2796

27/91

32/101

32/100

35/82

35/90

4607

27/90

29/100

31/99

23/81

32/89

39/93

0.600

0.593

0.612

02(Type H)* 0.673 361-2（Type Hs）

0.571

0.639 0.562 W95-2 0.778 2796 0.839 4607

（Type HG4） （Type HG4） （Type HG4）

0.513 F1 F2 F3

8213（Type G） 0.562 As165（Type Gs）

P Ps

0.729

0.640

0.626

* 括號(hào)內(nèi)所示為酯酶基因類型, Est gene types were shown inside the bracket.

圖2 以02和8213為出發(fā)親本的遺傳家系構(gòu)成及各菌株間的遺傳相似值

Fig 2 The constitution of the genetic family with parental strains 02 and 8213

and the values of genetic similarity between different individual strain

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1.單孢同核體的泳帶數(shù)量少于異核體,但也出現(xiàn)了某些異核體中沒(méi)有的新帶,單孢同核體與其異核親本及雜種子代間的遺傳相似值較低。2.子一代雜種W95-2與兩個(gè)異核親本02,8213之間的遺傳相似值分別為0.621和0.729;子二代雜種As2796與異核親本的相似值為0.593和0.640;子三代雜種As4607與異核親本的相似值為為0.600和0.626。而W95-2與As2796的相似值為0.778,As2796與As4607相似值為0.839。這些數(shù)據(jù)表明,隨著遺傳代數(shù)的增加,雜種子代與出發(fā)異核親本間的遺傳差距逐漸增大,但雜種子代間的遺傳相似值也逐漸增大。證明同核單孢雜交比傳統(tǒng)的單孢、多孢分離篩選更容易產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)明顯的新菌株，雜交菌株的遺傳特性可以通過(guò)單孢分離、篩選得以保持。

3.2 mtDNA酶切圖譜分析

實(shí)驗(yàn)使用四種內(nèi)切酶HaeⅢ(識(shí)別GG'CC)、CfoI(識(shí)別GCG'C)、MspI(識(shí)別C'CGG)、TaqI(識(shí)別T'CGA)對(duì)mtDNA粗提物進(jìn)行酶切,獲得的片段數(shù)達(dá)15-20條，接近純mtDNA酶切的效果。圖3、4顯示了用CfoI和HaeIII酶切mtDNA的電泳圖譜, 異核親本8213及其雜種W95-2(F1),As2796(F2)和As4607(F3)具有相同的線粒體基因型,而另一異核親本02具有另一種基因型,表明雙孢蘑菇的mtDNA呈單親遺傳,這和Sonnenberg(1991)的研究結(jié)果相一致。

圖3 mtDNA粗提物的CfoI酶切圖譜 圖4 mtDNA粗提物的HaeIII酶切圖譜

Fig 3 The digestion pattern of Fig 4 The digestion pattern of

crude mtDNA with CfoI crude mtDNA with HaeIII

1道: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 2道: 無(wú)酶對(duì)照; 3-7道: As2796, As4607, 8213, W95-2 和 02的酶切帶型

Lane 1: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; Lane 2: non-endonuclease CK; Lane 3-7: patterns of As2796, As4607, 8213, W95-2 and 02.

3.3 Est同工酶的PAGE圖譜分析

圖5顯示出發(fā)異核親本02和8213分屬H2型和G1型,而它們的同核單孢菌株361-2和As165保留了親本的標(biāo)記區(qū)帶e2,e4和e1,e3,但其它區(qū)帶數(shù)明顯減少形成Hs1和Gs2型酶譜,雜種W95-2(F1),As2796(F2)和As4607(F3)具有相同的Est酶譜,它們同時(shí)表達(dá)出雙親的標(biāo)記區(qū)帶e1,e2,e3,e4,呈典型的雜合態(tài),被稱為HG4型。上述結(jié)果表明,從異核親本分離出同核單孢株到雜交形成雜種子一代,Est同工酶標(biāo)記位點(diǎn)表現(xiàn)出遺傳和重組,形成傳統(tǒng)菌株(王澤生等,1989,1990)所沒(méi)有的新的基因類型,并能穩(wěn)定遺傳給其單孢子代As2796(F2)和As4607(F3),與此相吻合的是親本02的高產(chǎn)特征和8213的優(yōu)質(zhì)特征能通過(guò)雜交組合于雜交種W95-2(F1),其異核單孢分離株As2796(F2)和As4607(F3)保持了這種高產(chǎn)兼優(yōu)質(zhì)的特征,成為中國(guó)最廣泛使用的商品菌株(王澤生等,1995),證明Est同工酶標(biāo)記是雙孢蘑菇新菌株特性預(yù)測(cè)或鑒定的有效指標(biāo)。

圖5 雙孢蘑菇酯酶同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

Fig 5 PAGE patterns of esterase isozymes of A.bisporus

8213(G1), As165(Gs2), 02(H2), 361-2(Hs1), W95-2(HG4), As2796(HG4), As4607(HG4)

4.討論

應(yīng)用RAPD、mtDNA和同工酶等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)雙孢蘑菇商業(yè)雜交菌株As2796的家系進(jìn)行跟蹤分析,使我們對(duì)同核單孢菌株間雜交產(chǎn)生的雜種優(yōu)勢(shì)的內(nèi)涵及其遺傳有了更多的了解。在現(xiàn)有商品菌株間雜交產(chǎn)生的變異是有限的,雖然可以獲得更優(yōu)良的菌株,但改良程度受到限制。因此,充分利用野生種質(zhì),或近緣種(大肥菇等)進(jìn)行雜交就顯得十分重要。

mtDNA是真菌中最主要的染色體外遺傳物質(zhì),遺傳方式獨(dú)特。該遺傳系統(tǒng)雖受控于核系統(tǒng),但仍存在特殊的DNA復(fù)制機(jī)制,RNA拼接機(jī)制以及個(gè)別有別于"通用"密碼子的遺傳密碼子。國(guó)際上對(duì)雙孢蘑菇mtDNA的初步研究(Hintz等,1988;Sonnenberg等,1991;Jin等,1992)表明雙孢蘑菇mtDNA存在3-4種基因類型,雖然這些多態(tài)性明顯不如其它物種,但它和雙孢蘑菇重要性狀的關(guān)系仍然值得探討。尤其是雙孢蘑菇mtDNA呈現(xiàn)單親遺傳的現(xiàn)象在菌株改良中的應(yīng)用。假如某一親本的某一優(yōu)良性狀受控于mtDNA,那么利用單親遺傳特點(diǎn),讓這一親本的同核體處于生長(zhǎng)較快狀態(tài)與另一親本配對(duì)雜交,其子代就可能只承襲生長(zhǎng)較快狀態(tài)親本的基因型(Jin,1994),達(dá)到改良的目的。反之若承襲的是不良性狀的基因,那么菌株可能產(chǎn)生不如人意的退化現(xiàn)象。

福建省輕工業(yè)研究所于八十年代開展雙孢蘑菇同工酶PAGE表型與菌株特性相關(guān)研究,并成功地把同工酶電泳技術(shù)應(yīng)用于雙孢蘑菇菌株特性的預(yù)測(cè)(王賢樵等,1989;王澤生等,1989,1990),根據(jù)電泳表型可把雙孢蘑菇分為高產(chǎn)或H型,優(yōu)質(zhì)或G型,中間或HG1-2型,雜交或HG4-5型和同核不育或S型。近來(lái)又應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)三種重要類型菌株進(jìn)行分析,獲得相同結(jié)果,從另一角度證明了同工酶分型的可靠性(陳美元等,1998)。

參考文獻(xiàn)：

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MOLECULAR GENETIC STUDY ON THE FAMILY OF

HYBRID STRAIN AS2796 OF AGARICUS BISPORUS

Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou,350005

Abstract: The family of the hybrid A.bisporus strain As2796 was analyzed through molecular genetic markers tracking. The results were as follows. 1.RAPD analysis of total DNA showed that with the addition of the number of genetic generations, the genetic differences between hybrid offspring and their original heterokaryotic parents increased. 2.The patterns of mtDNA digested by endonucleases showed that the hybrid offspring had the same mitochondrial genotype as the parent 8213, which indicated that the mtDNA of A.bisporus was inherited from one of the parents. 3.PAGE patterns of esterase isozyme(Est) showed that the hybrid offspring which combined both the characteristic of high yield of parent 02 and good quality of 8213 had the same marked bands of their parents. The Est isozyme marker was found to be an effective index of new strains’ characteristic prediction or determination of A.bisporus.

Key words: Agaricus bisporus, Genetic family, Molecular heredity, RAPD, MtDNA, Esterase isozyme