雙孢蘑菇耐溫相關(guān)基因片段的分析

宋思揚 陳蘭芬 鄭忠輝 蘇文金

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 細胞生物學(xué)與腫瘤細胞工程教育部開放實驗室 廈門 361005）

陳美元 廖劍華 王澤生

（福建省輕工業(yè)研究所 福州 350005）

摘要 應(yīng)用RT-RAPD技術(shù)，以6bp隨機引物反轉(zhuǎn)錄雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）02菌株常溫培養(yǎng)和高溫誘導(dǎo)菌絲體的總RNA，10bp隨機引物PCR擴增，得到幾個高溫誘導(dǎo)差異片段，對U13引物的差異片段02U13克隆并測序，發(fā)現(xiàn)該片段編碼tRNAVal（密碼子GUC）基因。我們推測GUC可能是稀有密碼子，在某些耐溫基因中出現(xiàn)頻率較高。識別該稀有密碼子的tRNAVal在常溫條件下不表達或表達量很少，而在高溫誘導(dǎo)下引發(fā)一定的調(diào)控機制促使它們大量的合成，進一步引發(fā)相關(guān)的耐溫基因表達。

關(guān)鍵詞 雙孢蘑菇，RT-RAPD, 耐溫相關(guān)基因，tRNAVal

分類號

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus Lange (Imbach)]是一種富有營養(yǎng)的、具有很高經(jīng)濟價值和重要生態(tài)意義的栽培食用菌。雙孢蘑菇屬于穩(wěn)溫結(jié)實性的菌類。溫度是影響其生長的主要因素。在蘑菇種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中，控溫培養(yǎng)（15℃～24℃）使栽培成本升高，這一問題在我國南方尤其突出，也是造成雙孢蘑菇季節(jié)性栽培的主要原因[1]。加強和深化雙孢蘑菇的分子生物學(xué)研究，特別是充分運用現(xiàn)代生物技術(shù)尋找耐高溫基因并轉(zhuǎn)入蘑菇菌體以培育抗高溫，高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)的新菌株，具有十分重要的理論和實踐意義。

本文采用的RT-RAPD方法[2]與Peng Liang[3]和Strauss[4]建立的DDRT-PCR方法相類似，所不同的是利用6bp隨機引物而不是寡聚T進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物再用隨機引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，操作較為簡便。而且該方法可以對總RNA進行隨機擴增，以獲得差異表達的功能性基因。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：雙孢蘑菇菌株02，由福建省輕工業(yè)研究所蘑菇菌種研究推廣站提供。菌株培養(yǎng)用常規(guī)PDA培養(yǎng)基。大腸桿菌(Escherichia coli): DH5a菌株為本實驗室保存菌株。

1.2 方法

1.2.1雙孢蘑菇的常溫培養(yǎng)：24 oC條件下，培養(yǎng)兩周的液體PDA培養(yǎng)物。

高溫誘導(dǎo)培養(yǎng)：將常溫培養(yǎng)后生長良好的菌絲的PDA液體培養(yǎng)物放入32 oC培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)12h。

1.2.2總RNA提?。篊sCl 密度梯度離心方法[5]。

1.2.3 RNA樣品中DNA的去除：按考文獻[6]方法進行。

1.2.4 RNA的6堿基隨機引物反轉(zhuǎn)錄： 19μL含10μg無DNA的RNA,65 水浴10 min后, 加入5×RT buffer 8μL; DTT (100mmol/L)4μL; dNTPs (10mmol/L)2μL; 6隨機引物(50ng/μL) 5μL; M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL) 2μL。(以上試劑均為美國Promega公司產(chǎn)品)。反應(yīng)條件：22℃ 10min; 37℃ 60min; 70℃ 60min; 4℃保存。

1.2.5 1.2.5 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RAPD擴增：參照文獻[7]方法進行。30μL PCR反應(yīng)體系中含上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物１μL；10×PCR buffer 3μL; MgCl (25 mmol/L) 2μL; dNTPs (5mmol/L)1.5μL; 10堿基隨機引物（100 pmol/L）1; Taq酶（1U/μL）1.5μL; PCR用水補足余下體積。福建（以上試劑中引物為上海Sangon產(chǎn)品外，其它均為美國Promega公司產(chǎn)品）。反應(yīng)條件94 預(yù)變性2min; 之后進行42個以下循環(huán)：94℃1min; 38℃2min; 72℃1min; 最后72℃繼續(xù)延伸15min。

1.2.6 1.2.6 電泳：采用TAE緩沖系統(tǒng)，瓊脂糖凝膠濃度1.4%, PCR產(chǎn)物加量10μL,電壓8V/cm,電泳結(jié)果由EB染色得到。

1.2.7 1.2.7 差異片段的克隆和測序：按參考文獻[5]的方法，將差異片段克隆于pUCm-T載體。克隆子交上海Sangon測序。

2 2 結(jié)果

2.1 2.1 02 菌株不同溫度（24℃和32℃）的RT-RAPD擴增圖譜

雙孢蘑菇菌株０２常溫（24℃）培養(yǎng)及在高溫（32℃）誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后分別提取總RNA。用RNase-free的DNaseⅠ消化去除DNA，甲醛變性凝膠電泳確定為無降解的總RNA。經(jīng)6 bp隨機引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，本實驗用約二十種10 bp隨機引物分別進行PCR擴增，1.4%瓊脂糖電泳觀察RAPD條帶。其中OPU8、OPU12、OPU13、OPU19引物（引物序列見表１）擴增的RAPD圖譜中有差異條帶出現(xiàn)（圖１）。OPU8、OPU12 、OPU13的差異條帶是出現(xiàn)在誘導(dǎo)后的樣品中，而OPU19的差異帶則是在常溫培養(yǎng)的樣品中。結(jié)果都經(jīng)兩次重復(fù)。

表１ 10 隨機引物編號及核苷酸序列

Table １ Commercial number and DNA sequences of random primers

編 號Number 核苷酸序列(5’®3’)Sequence of primers 編號Number 核苷酸序列(5’®3’)Sequence of primers

OPU08 GGCGAAGGTT OPU12 TCACCAGCCA

OPU13 GGCTGGTTCC OPU19 GTCAGTGCGG

2.2 02菌株OPU13差異片段的克隆及序列分析

從上述的差異條帶中選取02菌株的OPU13 擴增產(chǎn)物中一條差異帶，分子量大約是525bp，命名為02U13，用OPU13作引物進行再次PCR擴增，獲得足夠濃度和純度的目的基因片斷。用T4 連接酶將目的片段與pUCm-T載體直接連接，用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,采用藍/白篩選，及選用目的片段上無內(nèi)切酶位點的限制性內(nèi)切酶Sac I 和 BamH I 限制性內(nèi)切酶作雙酶切鑒定，獲得含02U13差異片段的重組克隆子。

將含有目的差異片段的克隆子交上海生工生物工程有限服務(wù)公司測序。測序結(jié)果見圖2，序列的二級結(jié)構(gòu)分析見圖3。該序列用BLAST 軟件與GENBANK中已知序列進行比較,沒有發(fā)現(xiàn)值得注意的同源序列，用DNASIS軟件對該序列所有可能編碼的閱讀框進行分析，發(fā)現(xiàn)三種可能的編碼方式中均存在幾個短序列的完整閱讀框，我們認為該片段不太可能是蛋白質(zhì)的編碼序列。對該序列進行二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)該序列的一部分（No.27～No.115）可能是轉(zhuǎn)運Val的tRNA。

3討論

我們采用了RT-RAPD方法獲得與耐熱相關(guān)的DNA片段[2]。該方法不同與Peng Liang[3]和Strauss[4]建立的DDRT-PCR方法，它采用6bp隨機引物而不是寡聚T進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物再用隨機引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物直接用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，而不需要使用放射性同位素，也不需要進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，操作較為簡便。該方法也可以對總RNA進行隨機擴增。但是這種方法也存在一定的局限性，某些看似有和無的特異表達的條帶，可能只是表達量增加的序列；同時普通瓊脂糖電泳的分辨率也有限，某些差異條帶可能會被周圍的高濃度的其他條帶所掩蓋；而且有時在瓊脂糖上看似一條的差異帶，有可能事實上是多條DNA片段整合在一起的。因此為慎重起見，得到的差異條帶，還應(yīng)該多次證實其

24℃ 32℃ Marker 24℃ 32℃ Marker

21226 21226

5148 5148

4973 4973

4268 4268

3530 3530

2027 2027

1904 1904

1584 1584

1375 1375

947 947

831 831

564 564

A B

24℃ 32℃ Marker 24℃ 32℃ Marker

21226 21226

5148 5148

4973 4973

4268 4268

3530 3530

2027 2027

1904 1904

1584 1584

1375 1375

947 947

831 831

564 564

C D

圖１ 02菌株不同溫度（24℃和32℃）培養(yǎng)的RT-RAPD擴增圖譜

FIG.1 Amplification pattern of RT-RAPD of stain 02 cultured in different temperature（24℃ and 32℃）

Marker:λ DNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ marker

A、B、C、D ：Random primer OPU8 、OPU12、 OPU13 、OPU19 respectively

The differential fragments are marked with arrows

1 GGCGGCCGCC TGCAGACCAG GTCTGGCTGG TTCCATGGGA ACGACTACCA GCACCGACAG

61 TGCTCTGGGC GTAGATCCAG CAGTAAAGAG GACCACGACA TCAGGTGCGA GCAAGCGGAT

121 ATGATCGACC ATACCGGGCG AGGAACATAC TCATACAAGA TCCACGATAC GTCCAGTTGA

181 TTCAGGCTCT GGCGAAGAGG CTTGAGTATG CGTAAGAGCA GGTGTCGTAG GCGCTTTCTC

241 GGAGGGAGTC ATAACTTGAA GGAGGCAAAG GAAAAATACA ACTCCAACTA TGCCTGCCAG

301 TGGGATGGCG ATGGTGGAAC CAATCCGCGA GAGCGCAATG AACAACCAGT GGCCAAAGAA

361 AGATAGCATC CCCCAGGTAA AAGAGGCACC TGGAGCTGCG AATATGAGCG CAACCTTCTG

421 GAATTTATAT TTCCTGAGAA CTTGACTATG GAACCAGCCA AGACTGGAGA TCTGGATCCC

481 TCGAGTCTAG AGTCGACCTG CAGGCATGCA AGCTTGGCGT AATCA

圖2 02U13的DNA序列

5' C-G 3'

U-A

G A

G-C

U+G

U-A

C-G ACUA

C CGUGG

A A ! ! ! !

GGGU GGACC C

A ! + ! A ACGA

C ACUA G

G C A

C CU A

A-U G A

G-C G U

C-G G G

A-U C A

C G G C

C A U G

GAC A A

G C

A

U C

圖3 02U13序列（No.27～No.115）的二級結(jié)構(gòu)分析

Fig.3 Analysis the secondary structure of 02U13 sequence

可重復(fù)性。

由于考慮到與高溫誘導(dǎo)相關(guān)的序列并不局限于可翻譯為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,它也有可能是rRNA、tRNA 或其他一些功能性的序列，因此本實驗采用總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，并用6bp隨機引物反轉(zhuǎn)錄，在嚴格地去除DNA的污染，以免污染DNA干擾實驗結(jié)果的情況下，用6 bp隨機引物反轉(zhuǎn)錄，并用10 bp隨機引物進行PCR擴增，得到了可重復(fù)的多個差異條帶，對其中一個片段進行克隆并分析其序列特點，對其二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它可能是一個攜帶Val的tRNA。

高溫誘導(dǎo)與tRNAVal的特異表達有什么相關(guān)性？我們猜測，有可能該tRNA相應(yīng)的密碼子GUC是作為稀有密碼子在高溫誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達中起調(diào)控作用的。在不同的結(jié)構(gòu)基因中所用的密碼子可能會有很大的變化，同一種氨基酸的不同密碼子在不同基因中的使用頻率可能不同。編碼某些蛋白質(zhì)的基因內(nèi)存在一般情況下較少使用的所謂稀有密碼子，由于稀有密碼子相對應(yīng)的同功tRNA在細胞內(nèi)的數(shù)量較少，因此在翻譯過程中延長了核糖體在該mRNA上行經(jīng)的時間，從而降低了翻譯速度，使得富含稀有密碼子的基因處于不表達或低水平表達的狀態(tài)，因此該基因編碼的蛋白質(zhì)完全沒有或數(shù)量較少[8]。而在一定條件下，如果稀有密碼子相應(yīng)的tRNA在胞質(zhì)中的含量增加，就可能促使原先表達量較少或不表達的蛋白質(zhì)表達量增加，以發(fā)揮特定條件下的特定功能。在大腸桿菌中編碼Val的GUC密碼子是作為稀有密碼子使用的，在某些核糖體蛋白質(zhì)中編碼Val的GUC出現(xiàn)頻率只有5.17%（在四個Val的密碼子中，GUU使用了54次、GUA為40次、GUG為16次、而GUC只使用了6次），但它在哺乳動物基因中的出現(xiàn)頻率是68.3%（在四個Val的密碼子中，GUU使用了9次、GUA為5次、GUG為33次、GUC為21次），不是稀有密碼子[9]。至于在雙孢蘑菇中該密碼子是否是稀有密碼子，還未見到相關(guān)報道。如果在雙孢蘑菇中它確實是稀有密碼子的話，那么我們可以推測在高溫條件下，高溫誘導(dǎo)表達耐溫相關(guān)基因，在這些基因中該稀有密碼子的出現(xiàn)頻率較高，因而常溫條件下不表達或表達量很少，而在高溫誘導(dǎo)下引發(fā)一定的調(diào)控機制促使了識別該稀有密碼子的tRNAVal的大量合成，進一步促使了耐溫相關(guān)基因的表達。

參 考 文 獻

[1] 王澤生 編著 雙孢蘑菇規(guī)范化集約化栽培技術(shù)。福建省科學(xué)技術(shù)協(xié)會編，1998，pp13～14

[2]Sokolov B. P. and Prockop D. J. A rapid and simple PCR-based method for isolation of cDNAs from differentially expressed genes. Nucleic Acids Research，1994，22(19) 4009～4015

[3]Liang P. and Arthur B. Pardee. Differential display of Eukaryotic Messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science，1992，257: 967～970

[4].Strauss M., Bauer D. and Muller H. Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display techniquel DDRT-PCR. Nucleic Acid Res，1993，21: 4272～4280

[5] Sambrook J., Fritsch E. F. and Manistis T. Molecular cloning, a laboratory manual (2nd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989

[6]Liang P., Averboukh L. and Arthur B. Pardee. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization. Nucleic Acid Res，1993，21: 3269～3275

[7] Khush R. S., Becker E. and Wach M. DNA Amplification Polymorphisms of the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Appl Environ Microbiol.. 1992, 58:2971～2977

[8] 楊岐生 編著. 分子生物學(xué)基礎(chǔ)。浙江大學(xué)出版社，1994，pp. 217

[9] 孫乃恩，孫東旭，朱德煦 編著. 分子遺傳學(xué)。南京大學(xué)出版社，1996，pp. 251～254

Analysis of Agaricus bisporus Themotolerance related gene

Song Siyang, Chen Lanfen, Zheng Zhonghui, Su Wenjin

( The Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, School of Life Science,Xiamen University, Xiamen, 361005 P.R.CHINA)

Chen Meiyuan, liao jianhua, Wang Zesheng

(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, Fujian,350005, P.R.CHINA)

ABSTRACT Using the RT-RAPD method, total RNA was reverse-transcripted with 6bp random primer, then cDNA was amplified by PCR with 10bp random primer. Several related thermotolerance DNA fragments of strain 02 were obtained. The fragment 02U13 with OPU13 random primer was cloned and sequenced . We found that 02U13 is probable a gene fragment of tRNAVal. GUC may be a rare codon, and it is abundant in some related themotolerance genes. The gene of tRNAVal for GUC is silence or low activity at normal temperature. But it express actively when the organism was induced at high temperature, and result of the high expression of the themotolerance related genes.

KEY WORDS Agaricus bisporus, RT-RAPD, Themotolerance related gene, tRNAVal