藥用真菌Cv優(yōu)質(zhì)菌株誘變育種和營(yíng)養(yǎng)條件的初步研究

盛麗君

摘要：將Cv出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變處理，以生長(zhǎng)速度為指標(biāo)進(jìn)行初篩，結(jié)果在37株誘變株中選出8株生長(zhǎng)速度較快的菌株，進(jìn)一步通過深層發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)篩，分析這8株初篩誘變株的菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量，胞內(nèi)多糖得率最高的菌株分別是Cv-2和Cv-5，但考慮到Cv-2的菌絲體干重明顯小于Cv-5，故選Cv- 5為優(yōu)選菌株。研究不同碳、氮源對(duì)誘變株Cv-5菌絲體生物量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響，認(rèn)為玉米粉、淀粉是較好的碳源，黃豆餅粉、硝酸鉀是較好的氮源。對(duì)碳、氮源和無機(jī)鹽的主要影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)以及均勻試驗(yàn)后，確定最有利于菌絲體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1.0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4 ? 7H20 1.3%、KH2PO4 1.3%，菌絲體生長(zhǎng)量達(dá)1225.0mg/100ml。最適宜胞內(nèi)多糖合成的培養(yǎng)基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1 .0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4?7H20 0.3%、KH2PO4 1.1%，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量可達(dá)99.0mg/100ml。

關(guān)鍵詞：Coriolus vesicolor；紫外誘變；碳氮源試驗(yàn)

A Preliminary Study on the Breeding and Nutrition Condition

Of Coriolus vesicolor

Abstract: Coriolus vesicolor was treated with uv-irradiation, and 8 strains were selected by comparing their mycelial growing speeds from 37 strains. After submerged cultivated, those 8 strains were analyzed about their mycelial growth and intracellular polysaccharides. The results showed that No.5 was better in mycelial growth and intracellular polysaccharides production. After the effects of different carbon and nitrogen sources on mycelial growth and intracellular polysaccharides were studied, it was found that corn powder、starch、bean meal、Potassium Nitrate were the better carbon and nitrogen sources for the mycelial growth and intracellular polysaccharides. After the orthogonal test and the uniform design, the best composition of medium for the mycelial growth was thought as 2.5% corn powder、1.0% bean meal、0.3% Potassium Nitrate、1.3% MgSO4?7H20、1.3% KH2PO4 , the output of mycelial growth was 1225.0mg/100ml. The best composition of medium for intracellular polysaccharides was thought as 2.5% corn powder、1.0% bean meal、 0.3% Potassium Nitrate、0.3% MgSO4?7H20、1.1% KH2PO4 ，the output of intracellular polysaccharides was 99.0mg/100ml.

Key words: Coriolus vesicolor ; uv-irradiation; carbon and nitrogen test

0 引言

真菌不但是我國(guó)天然藥物資源和中草藥的一個(gè)極為重要的組成部分，而且已成為當(dāng)今探索和發(fā)掘抗癌藥物的重要領(lǐng)域。自從1951年美國(guó)人Reilly H 首次發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌有抑癌活性以來，特別是日本學(xué)者千原于1969年報(bào)道了香菇抗腫瘤多糖之后，在全球范圍內(nèi)掀起了一場(chǎng)從食藥用真菌中尋找抗癌藥物的熱潮，迄今為止已證明100多種真菌具有顯著的抗腫瘤活性[1-6]。已研究開發(fā)的真菌多糖產(chǎn)品有：香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖、金針菇多糖、竹蓀多糖等[1-9]。

云芝又稱彩色云芝、采絨革蓋菌(Coriolus vesicolor)，隸屬于靈芝科，已報(bào)道有日本的“PSK”[10]、中國(guó)的“PSP”、云芝多糖、云星等多種產(chǎn)品上市，它們不僅給腫瘤患者帶來了福音，也給生產(chǎn)廠家?guī)砹司薮蟮慕?jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

優(yōu)質(zhì)菌種是產(chǎn)品研發(fā)的基本前提。常見的擔(dān)子菌菌種選育方法有自然選育、誘變育種、雜交育種等[11-13]，近幾年來利用原生質(zhì)體融合技術(shù)和基因工程技術(shù)改造菌種的方法也取得了較大的進(jìn)展，但誘變育種仍是一個(gè)有效的方法[14-19]。在紫外線誘變育種的過程中，最適宜的誘變對(duì)象是單細(xì)胞、單核的個(gè)體，但擔(dān)子菌孢子的獲得往往受到季節(jié)的限制。因此對(duì)于不易獲得孢子或孢子不易萌發(fā)的菌種，可對(duì)其菌絲片段進(jìn)行誘變處理，以獲得優(yōu)質(zhì)菌株[20]。

本研究對(duì)一株云芝出發(fā)菌株進(jìn)行了紫外誘變育種，以期獲得深層培養(yǎng)時(shí)菌體生長(zhǎng)量多，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)菌株。同時(shí)還初步研究了其中一株優(yōu)質(zhì)菌種的深層發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高云芝多糖產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，提供優(yōu)質(zhì)菌株和最佳的營(yíng)養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

Cv菌株（Coriolus vesicolor）

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）

土豆 20%

蔗糖 2%

瓊脂 2%

pH 自然

1.2.2 液體培養(yǎng)基

1.2.2.1 種子培養(yǎng)基

玉米粉 3%

蔗 糖 1%

麥芽糖 1%

pH 自然

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

Ⅰ.葡萄糖 3% Ⅱ.葡萄糖 2%

黃豆餅粉 1% 蛋白胨 0.5%

MgSO4 ? 7H20 0.1% MgSO4 ? 7H20 1%

KH2PO4 0.1% KH2PO4 2%

pH 自然 pH 自然

Ⅲ.葡萄糖 2% Ⅳ.玉米粉 2.5%

蛋白胨 0.5% 黃豆餅粉 1.0%

MgSO4 ? 7H20 0.1% 硝酸鉀 0.3%

KH2PO4 0.2% MgSO4 ? 7H20 0.1%

pH 自然 KH2PO4 0.1%

pH 自然

1.2.2.3 碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基

以發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ?yàn)榛A(chǔ)，將2%葡萄糖分別替換成：檸檬酸、甘油、蔗糖 、麥芽糖、糊精、淀粉、玉米粉7種碳源進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2.4 氮源試驗(yàn)培養(yǎng)基

以發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅲ為基礎(chǔ)，將0.5%蛋白胨分別替換成：牛肉浸膏、酵母粉、麩皮、黃豆餅粉、硫酸銨、硝酸鉀6種氮源進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 斜面培養(yǎng)

從原始Cv菌株的斜面中取出約0.5cm2大小的一塊菌絲體接種于PDA斜面上，28℃恒溫培養(yǎng)5d左右。

1.3.2 液體培養(yǎng)

1.3.2.1 種子培養(yǎng)

將斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基后，于28±1℃，140±10rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)2d。

1.3.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)物接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28±1℃，140±10rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)5-6d。

1.4 紫外誘變育種

1.4.1 紫外誘變

在無菌條件下，刮取已活化的菌絲體片段，用2ml的生理鹽水洗滌斜面，制成菌絲體懸液，用脫脂棉過濾于裝有玻璃珠的錐形瓶中，28±1℃，140±10rpm 搖床上振搖30min后，將菌絲體懸液置于15W紫外燈下30cm處，分別用1″、10″、40″、1′、2′的劑量進(jìn)行紫外誘變。誘變后的菌液進(jìn)行梯度稀釋后，用移液管吸取適量體積，涂布PDA平皿，28℃避光培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果并記錄。

1.4.2 菌株篩選

紫外誘變后，將PDA平皿上直徑大，菌絲生長(zhǎng)茂盛的菌落轉(zhuǎn)接于PDA斜面中，28℃避光培養(yǎng)，7d后觀察并記錄各菌絲體的生長(zhǎng)長(zhǎng)度。將初篩出的生長(zhǎng)速度較快的誘變株分別接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中，28±1℃，140±10rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)6d，分析各誘變菌株的菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量。

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲體干重

振蕩培養(yǎng)后的發(fā)酵液抽濾后，獲菌絲體和濾液，菌絲體用蒸餾水洗滌抽濾3次后于60℃烘箱烘干至恒重，稱得菌絲體干重。

1.5.2 胞內(nèi)多糖測(cè)定

將菌絲體研磨成細(xì)粉，加入20ml蒸餾水，95±2℃下水浴浸提3小時(shí)后，加入4倍體積的95%乙醇，置于4℃冰箱過夜，4000r/min離心10分鐘，棄上清液，沉淀物于60℃烘箱烘干至恒重，稱重即為胞內(nèi)多糖。

1.5.3 多糖得率

多糖得率（%）= 胞內(nèi)多糖干重/菌絲體干重×100%

1．6 營(yíng)養(yǎng)條件試驗(yàn)

1.6.1 碳氮源試驗(yàn)

將發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中的碳源分別替換成2%檸檬酸、甘油、葡萄糖、蔗糖 、麥芽糖、糊精、淀粉、玉米粉，接10%種子培養(yǎng)物，每種碳源作3次重復(fù)。28±1℃，140±10rpm振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)量并比較8種碳素營(yíng)養(yǎng)對(duì)菌絲體干重、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。

將發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅲ中的0.5%氮源分別換成蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、麩皮、黃豆餅粉、硫酸銨、 硝酸鉀，接10%種子培養(yǎng)物，每種氮源作3次重復(fù)。28±1℃，140±10rpm振蕩培養(yǎng)5d后測(cè)量并比較7種氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)菌絲體干重、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。

1.6.2 碳氮源的正交試驗(yàn)

將碳氮源單因子試驗(yàn)中，菌絲體生長(zhǎng)量大，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量高的4種碳氮源進(jìn)行L9（34）的9組正交試驗(yàn)，28±1℃，140±10rpm振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)量并比較各種不同碳氮源因子對(duì)菌絲體干重、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。

1.6.3 無機(jī)鹽試驗(yàn)

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅴ中的MgSO4 ? 7H20 、KH2PO4 進(jìn)行U7（72）的7組均勻試驗(yàn)，28±1℃，140±10rpm振蕩培養(yǎng)6d后，測(cè)量并比較各種不同無機(jī)鹽因子對(duì)菌絲體干重、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cv出發(fā)菌株的誘變育種

2.1 .1 紫外誘變

活化培養(yǎng)后的菌絲片段分別用1″、10″、40″、1′、2′的劑量進(jìn)行紫外誘變，誘變后的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布PDA平皿，28℃避光培養(yǎng)3d后，進(jìn)行菌落記數(shù)。結(jié)果見圖1。

圖1 紫外照射對(duì)Cv菌株的影響

從圖1可見：隨著紫外照射劑量的增加，菌株的致死率逐漸升高，到2分鐘時(shí)已達(dá)96.65%。

2.1.2 Cv誘變菌株的初篩

當(dāng)處理劑量大時(shí)，殺菌率高（90～99%），在單位存活細(xì)胞中負(fù)突變菌株多，正突變菌株少。用小劑量進(jìn)行誘變處理時(shí)，殺菌率約為50～80%，在單位存活細(xì)胞中正突變株多[21]。所以選取紫外照射1′的誘變菌株（致死率為85.82%）直徑大，菌絲生長(zhǎng)茂盛的菌落轉(zhuǎn)接于PDA斜面中，28℃避光培養(yǎng)7d后，測(cè)量菌絲體生長(zhǎng)長(zhǎng)度。結(jié)果見表1。

表1 Cv誘變株的初篩試驗(yàn)

菌株 Strains 菌絲體生長(zhǎng)長(zhǎng)度 （mm） 平均長(zhǎng)度 （mm） 日生長(zhǎng)速度 （mm/d） 差值 (mm)

出發(fā)菌株 45 45 45.0 6.43 0.00

1 53 50 51.5 7.36 0.93

2 55 55 55.0 7.86 1.43

3 50 50 50.0 7.14 0.71

4 52 44 48.0 6.86 0.43

5 55 55 55.0 7.86 1.43

6 52 56 54.0 7.71 1.28

7 47 47 47.0 6.71 0.28

8 52 52 52.0 7.43 1.00

9 46 46 46.0 6.57 0.14

10 54 55 54.5 7.79 1.36

11 40 40 40.0 5.71

12 34 38 36.0 5.14

13 53 56 54.5 7.79 1.36

14 38 45 41.5 5.93

15 55 55 55.0 7.86 1.43

16 55 55 55.0 7.86 1.43

17 45 40 42.5 6.07

18 40 43 41.5 5.93

19 54 54 54.0 7.71 1.28

20 30 30 30.0 4.29

21 48 48 48.0 6.86 0.43

22 55 55 55.0 7.86 1.43

23 44 46 45.0 6.43 0.00

24 52 52 52.0 7.43 1.00

25 20 20 20.0 2.86

26 30 42 36.0 5.14

27 52 52 52.0 7.43 1.00

28 48 48 48.0 6.86 0.43

29 48 50 49.0 7.00 0.57

30 43 43 43.0 6.14

31 42 42 42.0 6.00

32 53 55 54.0 7.71 1.28

33 55 55 55.0 7.86 1.43

34 53 52 52.5 7.50 1.07

35 52 50 51.0 7.29 0.86

36 43 43 43.0 6.14

37 42 42 42.0 6.00

由表1可知：在37株誘變株中，Cv-1、Cv-2、Cv-3、Cv-4、Cv-5、Cv-6、Cv-7、Cv-8、Cv-9、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-19、Cv-21、Cv-22、Cv-23、Cv-24、Cv-27、Cv-28、Cv-29、Cv-32、Cv-33、Cv-34和Cv-35這25株誘變株的生長(zhǎng)速度大于出發(fā)菌株。

對(duì)初篩試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作極差分析，結(jié)果見表2：

表2 Cv-xi誘變株生長(zhǎng)速度頻數(shù)分布表

組限 組中值（xc） 頻數(shù)（f）

(A)1.62～1.35 1.485 8

(B)1.34～1.08 1.215 3

(C)1.07～0.81 0.945 6

(D)0.80～0.54 0.675 2

(E)0.53～0.27 0.405 4

(F)0.26～0.00 0.135 2

極差分析表明：A組中8個(gè)誘變菌株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33與Cv出發(fā)菌株的菌絲體生長(zhǎng)速度差值最大，菌絲體生長(zhǎng)速度明顯高于出發(fā)菌株。

2.1.3 Cv誘變菌株的復(fù)篩

將生長(zhǎng)速度最快的誘變菌株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33，分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ中振蕩培養(yǎng)6d后，比較它們的菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量。結(jié)果見表3。

表3 Cv誘變株的復(fù)篩試驗(yàn)

菌株 Strains 菌絲體干重 （mg/100ml） 胞內(nèi)多糖 （mg/100ml） 得率 （%）

出發(fā)菌株 1176.50 89.00 7.56

2 427.00 172.25 40.34

5 667.50 163.25 24.46

10 746.00 63.50 8.51

13 1210.00 108.25 8.95

15 1046.00 54.25 5.20

16 972.50 55.00 5.66

22 1228.00 67.25 5.48

33 1088.50 107.50 9.88

由表3可知：8個(gè)誘變株經(jīng)深層培養(yǎng)后，誘變株Cv-13、Cv-22比出發(fā)菌株的菌絲體生長(zhǎng)量高。從胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量來看，誘變株Cv-2、Cv-5、Cv-13、Cv-33與出發(fā)菌株相比有不同程度的提高，其中Cv-2的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量最高，為出發(fā)菌株的1.9倍；Cv-5的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量位于第二，為出發(fā)菌株的1.8倍。從胞內(nèi)多糖的得率來看，誘變株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-33得率與出發(fā)菌株相比有不同程度的提高，其中Cv-2、Cv-5得率明顯高于出發(fā)菌株。綜合考慮，選取Cv-5作為深層發(fā)酵的優(yōu)選菌株。

2.2 誘變株Cv-5的營(yíng)養(yǎng)條件試驗(yàn)

2.2.1 碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

碳源是微生物培養(yǎng)基的一個(gè)重要成分，它主要用于合成細(xì)胞碳素物質(zhì)，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量[11]。對(duì)Cv-5優(yōu)選菌株進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。本實(shí)驗(yàn)選用檸檬酸、甘油、葡萄糖、蔗糖 、麥芽糖、糊精、淀粉、玉米粉8種不同的碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，比較這幾種碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果見表4。

表4 幾種碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

碳源 菌絲體干重 （mg/100ml） 胞內(nèi)多糖 （mg/100ml） 得率 （%）

檸檬酸 70.50 8.50 12.06

甘油 803.50 30.33 3.77

葡萄糖 792.50 18.83 2.38

蔗糖 811.00 32.33 3.99

麥芽糖 816.50 22.83 2.80

糊精 805.50 26.67 3.31

淀粉 818.00 40.17 4.91

玉米粉 1081.00 33.17 3.07

由表4可知：供試菌株在這幾種碳源中均能生長(zhǎng)，并能合成胞內(nèi)多糖，但不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響有差異。當(dāng)碳源為玉米粉時(shí)，誘變株Cv-5的菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)量最多，為1081.00mg/100ml，其次是淀粉，為818.00mg/100ml。而最利于胞內(nèi)多糖合成的碳源為淀粉，誘變株Cv-5的胞內(nèi)多糖產(chǎn)量可達(dá)40.17mg/100ml，其次是玉米粉，為33.17 mg/100ml。另外，當(dāng)碳源為檸檬酸時(shí)，胞內(nèi)多糖得率最高，為12.06 %，與位于第二的4.91 %(淀粉為碳源)相差較大，但碳源為檸檬酸時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)量最少，可見檸檬酸不利于誘變株Cv-5的生長(zhǎng)，而且作為發(fā)酵碳源成本較高。從成本、菌絲體生長(zhǎng)量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量等因素綜合考慮，誘變株Cv-5最適宜碳源為玉米粉、淀粉。

2.2.2 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)與胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

氮源主要用于構(gòu)成菌絲體細(xì)胞物質(zhì)和含氮的目的產(chǎn)物[11]。本實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)氮源蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、麩皮、黃豆餅粉和硫酸銨、 硝酸鉀等無機(jī)氮源進(jìn)行深層發(fā)酵試驗(yàn)，研究不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果見表5。

表5 幾種氮源對(duì)菌株的菌絲體生長(zhǎng)與胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

氮源 菌絲體干重 （mg/100ml） 胞內(nèi)多糖 （mg/100ml） 得率 （%）

蛋白胨 442.50 14.00 3.16

牛肉浸膏 473.00 10.33 2.18

酵母粉 415.00 9.00 2.17

麩皮 335.00 18.67 5.57

黃豆餅粉 441.50 16.33 3.70

硫酸銨 237.50 3.33 1.40

硝酸鉀 714.00 31.67 4.44

由表5可知：當(dāng)?shù)礊橄跛徕洉r(shí)，誘變株CV-5的菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)量最多，為714.00mg/100ml，其次是牛肉浸膏，為473.00mg/100ml。而最適宜胞內(nèi)多糖合成的氮源是硝酸鉀、麩皮和黃豆餅粉，產(chǎn)量分別31.67mg/100ml 、18.67mg/100ml和16.33mg/100ml。另外，當(dāng)?shù)礊辂熎?、硝酸鉀和黃豆餅粉時(shí)，胞內(nèi)多糖得率分別是5.57%、4.44%和3.70%。從菌絲體生長(zhǎng)量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量?jī)梢蛩乜紤]，認(rèn)為硝酸鉀、麩皮、黃豆餅粉是有利于誘變株CV-5菌絲體生長(zhǎng)和胞內(nèi)產(chǎn)多糖的氮源；從成本、菌絲體生長(zhǎng)量、胞內(nèi)多糖產(chǎn)量等因素綜合考慮，認(rèn)為硝酸鉀、黃豆餅粉是有利于誘變株CV-5菌絲體生長(zhǎng)和胞內(nèi)產(chǎn)多糖的氮源。

2.2.3 碳氮源的正交試驗(yàn)

單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碳、氮源中玉米粉、淀粉、黃豆餅粉、硝酸鉀對(duì)誘變株Cv-5的菌絲體生長(zhǎng)量及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量影響最大。為考慮這些因子協(xié)同作用，并確定其最佳組成及配比，選用玉米粉、淀粉、黃豆餅粉、硝酸鉀四因子，各取3個(gè)水平L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果見表6、表7。

表6 正交實(shí)驗(yàn)因子水平表

因子 玉米粉 淀粉 黃豆餅粉 硝酸鉀

水平 A（%） B（%） C（%） D（%）

1 1.5 0.0 0.5 0.0

2 2.0 1.0 1.0 0.3

3 2.5 1.5 1.5 0.5

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析

因素 實(shí)驗(yàn)號(hào) A B C D 菌絲體干重 (mg/100ml) 胞內(nèi)多糖干重 （mg/100ml）

1 1（1.5） 1（0.0） 1（0.5） 1（0.0） 759.0000 42.1667

2 1（1.5） 2（1.0） 2（1.0） 2（0.3） 612.0000 67.6667

3 1（1.5） 3（1.5） 3（1.5） 3（0.5） 902.5000 45.5000

4 2（2.0） 1（0.0） 2（1.0） 3（0.5） 744.5000 76.0000

5 2（2.0） 2（1.0） 3（1.5） 1（0.0） 1077.5000 65.0000

6 2（2.0） 3（1.5） 1（0.5） 2（0.3） 607.5000 76.6667

7 3（2.5） 1（0.0） 3（1.5） 2（0.3） 1183.0000 99.3333

8 3（2.5） 2（1.0） 1（0.5） 3（0.5） 603.0000 64.8333

9 3（2.5） 3（1.5） 2（1.0） 1（0.0） 1081.0000 90.0000

K1 菌 K2 體 K3 干 k1 重 k2 k3 R 2273.5000 2429.5000 2867.0000 757.8333 809.8333 955.6667 197.8334 2686.5000 2292.5000 2591.0000 895.5000 764.1667 863.6667 131.3333 1969.5000 2437.5000 3163.0000 656.5000 812.5000 1054.3333 397.8333 2917.5000 2402.5000 2250.0000 972.5000 800.8333 750.0000 222.5000

K1 胞 K2 內(nèi) K3 多 k1 糖 k2 干 k3 重 R 155.3334 217.6667 254.1666 51.7778 72.5556 84.7222 32.9444 217.5000 197.5000 212.1667 72.5000 65.8333 70.7222 6.6667 183.6667 233.6667 209.8333 61.2222 77.8889 69.9444 16.6667 197.1667 243.6667 186.3333 65.7222 81.2222 62.1111 19.1111

由表7可知：各試驗(yàn)因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響程度為 C＞D＞A＞B，即黃豆餅粉是影響菌絲生長(zhǎng)的主要因素（R=397.8333），硝酸鉀、玉米粉是次要因素（R=222.5000、197.8334）,淀粉對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響最?。≧=131.3333）。理論上最利于菌絲體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組合為 A3 B1 C3 D1 ，即玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1.5% 。各試驗(yàn)因素對(duì)胞內(nèi)多糖的影響程度為 A＞D＞C＞B , 即玉米粉是影響胞內(nèi)多糖合成的主要因素（R=32.9444），硝酸鉀、黃豆餅粉是次要因素（R=19.1111、16.6667）,淀粉對(duì)胞內(nèi)多糖的影響最?。≧=6.6667）。理論上最適宜胞內(nèi)多糖合成的培養(yǎng)基組成為 A3 B1 C2 D2 ，即玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1 .0% 、硝酸鉀0.3% 。

對(duì)正交試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作多元線性回歸分析，結(jié)果如下：

a、對(duì)菌絲體生物量的回歸分析：

回歸方程式: Y = 201 .15 + 197.83 A - 36.95 B + 397.83 C - 455.04 D

相關(guān)系數(shù) R = 0.958 * （ R 0.05 = 0.930 ， R 0.01 = 0.970 ）

說明各因素與菌絲體生物量之間存在著顯著的相關(guān)。

標(biāo)準(zhǔn)差 Se = 92.66

F值 11.05

樣本數(shù) N = 9

表8 方差分析表

變異來源 df ss S2 F F0.05 F0.01

回歸 4 379575.37 94893.84 11.05* 6.388 15.98

剩余 4 34346.52 8586.63

總的 8 413921.89

F檢驗(yàn)顯著,說明回歸方程揭示的規(guī)律性強(qiáng)。

b、對(duì)胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的回歸分析：

回歸方程式： Y = - 2.581 + 32.94 A - 1.97 B + 8.72 C - 2.57 D

相關(guān)系數(shù) R = 0.796

標(biāo)準(zhǔn)差 Se =15.92

F值 1.73

樣本數(shù) N = 9

經(jīng)方差分析，差異不顯著。

2.2.4 無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

微生物在生長(zhǎng)繁殖和合成目的產(chǎn)物的過程中，需要某些無機(jī)鹽和微量元素以作為其生理活性物質(zhì)的組成或生理活性物質(zhì)合成時(shí)的調(diào)節(jié)物。這些物質(zhì)一般在低濃度時(shí)對(duì)微生物生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用，在高濃度時(shí)常表現(xiàn)出明顯的抑制作用[11]。因此，培養(yǎng)基成分中的無機(jī)鹽濃度也是影響微生物生理活性的重要因子。采用均勻試驗(yàn)的方法，比較MgSO4 ? 7H20和KH2PO4 這兩種無機(jī)鹽及不同濃度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表9、表10。

表9 均勻試驗(yàn)因子水平表

水平因子 1 2 3 4 5 6 7

A MgSO4 ? 7H20(%) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3

B KH2PO4 (%) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3

表10 均勻試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果

試驗(yàn)次數(shù) A B 菌絲干重 （mg/100ml） 胞內(nèi)多糖干重 （mg/100ml）

1 1(0.1) 3(0.5) 573.0 61.8333

2 2(0.3) 6(1.1) 893.0 99.0000

3 3(0.5) 2(0.3) 718.5 49.1667

4 4(0.7) 5(0.9) 936.5 57.5000

5 5(0.9) 1(0.1) 855.5 82.0000

6 6(1.1) 4(0.7) 715.0 61.6667

7 7(1.3) 7(1.3) 1225.0 92.0000

對(duì)均勻試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作多元線性回歸分析，結(jié)果如下：

a、 對(duì)菌絲體生物量的回歸分析：

回歸方程式： Y = 400.46 + 310.18 A + 325.18 B

相關(guān)系數(shù) R = 0.929 * （ R0.05 = 0.811 ， R0.01 = 0.949 ）

說明各因素與菌絲體生物量之間存在著顯著的相關(guān)。

標(biāo)準(zhǔn)差 Se = 94.72

F值 6.41

樣本數(shù) N = 7

表11 方差分析表

變異來源 df ss S2 F F0.05 F0.01

回歸 2 226187.09 113093.55 12.61* 6.944 18.00

剩余 4 35885.34 8971.34

總的 6 262072.43

F檢驗(yàn)顯著,說明回歸方程揭示的規(guī)律性強(qiáng)。

分析回歸方程式，可以看出各項(xiàng)系數(shù)均為正值。所以，在考察的配比范圍內(nèi)，A、B取值越大，菌絲生長(zhǎng)情況越好。故優(yōu)化結(jié)果，將A =1.3 , B =1.3 代入回歸方程中得理論上菌絲體生物量的最大值及其波動(dòng)范圍。

= 1226.43 mg/100ml

Y = U α * Se ( 查表得： U 0.05 =　1.645 )

Y = 1226.43 155.81 mg/100ml

所以，優(yōu)化結(jié)果的菌絲干重的范圍是：1070.62 ～ 1382.24 mg/100ml。

(查表得： U 0.05 =　1.645)

b、對(duì)胞內(nèi)多糖干重回歸分析：

回歸方程式： Y = 191.84 + 42.20 A - 6.06 B

相關(guān)系數(shù) R = 0.471 * （ R0.05 = 0.811 ， R0.01 = 0.949 ）

說明各因素與菌絲體生物量之間存在著顯著的相關(guān)。

標(biāo)準(zhǔn)差 Se = 42.21

F值 0.57

樣本數(shù) N = 7

經(jīng)方差分析，差異不顯著。

小結(jié)：

1、出發(fā)菌株Cv經(jīng)紫外誘變處理后，選取紫外照射劑量為1′的誘變菌株在PDA斜面上培養(yǎng)，篩選出8個(gè)優(yōu)質(zhì)菌株。分別是Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33。從菌絲體生長(zhǎng)量來看，誘變株Cv-22最高，達(dá)1228.00mg/100ml ，其次是誘變株Cv-13，達(dá)1210.00mg/100ml。從胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量來看，誘變株Cv-2最高，為172.25mg/100ml，其次是誘變株Cv-5，為163.25mg/100ml。本次紫外誘變育種挑選出4個(gè)優(yōu)質(zhì)菌種，為Cv-2、Cv-5、Cv-13、Cv-33。

2、選取誘變株Cv-5作為進(jìn)一步深層發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)菌株，該菌株在PDA斜面上生長(zhǎng)速度快，達(dá)7.86 mm/d，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。在發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體生長(zhǎng)量和胞內(nèi)多糖產(chǎn)量較出發(fā)菌株有明顯的提高（菌絲體生長(zhǎng)量為667.50mg/100ml，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為163.25mg/100ml，得率為24.46%）。

3、對(duì)優(yōu)質(zhì)菌株Cv-5的營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行初步的研究。碳氮源試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、均勻試驗(yàn)結(jié)果表明，最有利于菌絲體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1.0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4 ? 7H20 1.3%、KH2PO4 1.3%，菌絲體生長(zhǎng)量達(dá)1225.0mg/100ml。最適宜胞內(nèi)多糖合成的培養(yǎng)基的最佳配比為：玉米粉2.5% 、黃豆餅粉1 .0% 、硝酸鉀0.3% 、MgSO4?7H20 0.3%、KH2PO4 1.1%，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量可達(dá)99.0mg/100ml。

參考文獻(xiàn)： 略