靈芝胞外多糖高產(chǎn)菌株篩選及其深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

宋頻然，常繼東(華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海200237)

靈芝(Ganoderma zucidum)隸屬于擔子菌綱(BaSidiomycetes)，多孑L菌目(PolyporaleS)，多孔菌科(Polyporaceae)，靈芝屬(Ganoderma)，是中醫(yī)藥寶庫中的珍品，藥用歷史悠久。靈芝的現(xiàn)代研究始于20世紀50年代末，半個世紀以來，在真菌化學、藥理作用、人工馴化、栽培技術(shù)、液體發(fā)酵和產(chǎn)品加工等方面都有長足的進展[1-5]。靈芝液體發(fā)酵研究主要集中于提高菌絲體、靈芝多糖和靈芝酸的產(chǎn)量[1,6-8]，而對靈芝液體發(fā)酵菌種的選育研究甚少[8-10]。應用自身代謝終產(chǎn)物耐受性原理進行抗生素高產(chǎn)菌株篩選的篩選模型已普遍被應用，但應用蕈菌胞外多糖的反饋抑制原理篩選蕈菌胞外多糖高產(chǎn)菌株的研究尚未見報道。本文應用靈芝胞外多糖反饋抑制原理[11]構(gòu)建了一個篩選模型，并用它篩選37株靈芝菌株，檢出一株強耐同源胞外多糖反饋抑制、產(chǎn)胞外多糖能力最強的靈芝菌株GL029，進而優(yōu)化GL029的深層發(fā)酵培養(yǎng)基。

1材料與方法

1．1耐反饋抑制篩選模型的構(gòu)建

1．1．1構(gòu)建篩選模型的理論依據(jù)、

在靈芝液體發(fā)酵過程中，自身終產(chǎn)物胞外多糖(EPS)具有反饋抑制作用。對菌株GL002(韓芝2號)來說，培養(yǎng)液中EPS的濃度高于0．59g／L時，EPS的產(chǎn)生受到明顯抑制，其趨勢是隨著培養(yǎng)液中EPS濃度的增加，反饋抑制作用逐漸增強。當EPS濃度達到2．34g/L時，菌絲的生長和EPS的產(chǎn)生完全被抑制，即該菌株對自身代謝終產(chǎn)物EPS的最大耐受濃度為2．34g/L[11]。將該濃度的同源靈芝胞外多糖添加到液體培養(yǎng)基中，對若干靈芝菌株分別進行同步深層發(fā)酵，凡不能生長者，則其對自身終產(chǎn)物EPS的耐受濃度小于2．34dL，反之則高于2．34g/L。耐受性越強，其EPS的生產(chǎn)能力也越強。

1．1．2篩選模型指示因子

GL002菌株于30℃、120r／min避光培養(yǎng)9d，然后用醇沉法[11]提取胞外多糖(EPS)，所得靈芝胞外粗多糖即為篩選模型指示因子。

1．1．3篩選模型指示因子提取培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方為蔗糖30g，酵母浸膏1g，(NH4)2S041g，KH2P04?7H20 1g，KCl 0．5g， FeS040．01g，水1000mL。

1．1．4篩選培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方為蔗糖30g，酵母浸膏1g，(N地)2S041g，KH2P04?7H20 1g，KCl 0．5g， FeS040．01g，濃度為2．34g/L篩選模型指示因子的水溶液1000mL。

1．1．5篩選培養(yǎng)

將4℃保藏的出發(fā)菌株置常溫下活化后，接種至PDA斜面，28℃避光培養(yǎng)7d。然后接種到PDA平板，28℃避光培養(yǎng)5d。平板種子接入滅菌后裝有100mL篩選培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，每個搖瓶用φ6mm的打孔器接種平板種子12塊，種子皆取自菌落邊沿區(qū)域。于30℃、120r／min避光培養(yǎng)9d。

1．1．6篩選檢測

當篩選培養(yǎng)進入第6天時(對數(shù)期為第2天至第6天[1l])，檢查搖瓶中菌絲生長情況，則可直接淘汰既未生長、又無染菌的菌株。做相關(guān)紀錄。有菌絲生長者，則繼續(xù)培養(yǎng)至終點，用醇沉法[11]提取胞外多糖(EPS)，稀釋至80倍，用硫酸一酚法[12,13]測定其濃度。比較指示因子數(shù)值，檢出強耐反饋抑制菌株。

1．1．7篩選模型的模擬運行和驗證

從37株出發(fā)菌株中隨機選取5株，按照1．1．5的方法分別接入1．1．3的篩選模型指示因子提取培養(yǎng)基和1．1．4的篩選培養(yǎng)基，進行同步篩選培養(yǎng)，從接人篩選模型指示因子提取培養(yǎng)基中的5個菌株中檢出胞外多糖產(chǎn)量最高的菌株。從接入篩選培養(yǎng)基中相同的5個菌株中檢出強耐反饋抑制菌株，比較兩種篩選方法所得結(jié)果的一致性，以確定篩選模型的可行性和可靠性。

1．2強耐反饋抑制作用胞外多糖高產(chǎn)菌株的檢出

1．2．1出發(fā)菌株

37株出發(fā)菌株的編號為GL001、GL002、GL003、GL004、GL005、GL006、GL007、GL008、 GL009、GL010、GL011，GL012，GL013、GL014 、 GL015、GL0161 GL017、GL018 、 GL019、 GL020、 GL021、GL022、GL023、GL024、GL025、GL026、GL027、GL028、GL029、GL031、GL032、GL033、 GL034、GL035、GL036、GL037、GL039，由華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室保藏。

1．2．2篩選操作

將37株出發(fā)菌株中除已在耐反饋抑制篩選模型模擬運行試驗中輸入該模型的5株之外

的32株菌株，按照既定程序輸入該模型，考察其表現(xiàn)，統(tǒng)一比較37株出發(fā)菌株的耐反饋抑制作用強度，檢出一株耐受性最強的菌株，即為胞外多糖高產(chǎn)菌株。

1．3既得靈芝胞外多糖高產(chǎn)菌株深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1．3．1基礎(chǔ)培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為蔗糖10g，酵母浸膏l(xiāng)g,KH2P04?7H2O 0．5g，水1000mL。

1．3．2正交試驗設(shè)計

根據(jù)靈芝深層發(fā)酵的營養(yǎng)需求，本試驗在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選取碳源(玉米粉)、氮源(蛋白胨)、鉀(氯化鉀)、硫酸鎂四因素，每因素設(shè)三個水平(表1)。選擇無交互作用的正交表L9(3 4)[14,15]將四因素任意地排列在四個列號的任何列上，進行既得胞外多糖高產(chǎn)菌株深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究(表2)。

2結(jié)果與分析

2．1耐反饋抑制篩選模型及其操作法

2．1．1耐反饋抑制篩選模型的結(jié)構(gòu)

根據(jù)1．1．1構(gòu)建篩選模型的理論，經(jīng)多次試驗，確立了耐反饋抑制篩選模型框架，它包括篩選指示因子、篩選培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)、篩選檢測四部分，外圍結(jié)構(gòu)為出發(fā)菌株。結(jié)構(gòu)關(guān)系如圖1所示。

2．1．2篩選操作程序

通過出發(fā)菌株GL002深層發(fā)酵獲取的篩選指示因子僅供2d內(nèi)備用。準備好篩選模型指示因子和出發(fā)菌株的平板種子之后，才制備篩選培養(yǎng)基。時間掌握不好，易出現(xiàn)種子老化和篩選模型指示因子感染雜菌。然后把出發(fā)菌株平板種子接到篩選培養(yǎng)基中。當篩選培養(yǎng)進行到第6天時，直接淘汰未感染雜菌而菌絲不生長的菌株：繼續(xù)培養(yǎng)在篩選培養(yǎng)基中能生長的出發(fā)菌株至設(shè)定的終點，測定篩選培養(yǎng)醪中靈芝胞外多糖總濃度，其中，胞外多糖總濃度最高的菌株就是耐反饋抑制作用最強的、靈芝胞外多糖高產(chǎn)菌株。

2．1．3耐反饋抑制篩選模型的模擬運行與驗證

從37株出發(fā)菌株中隨機選取的GL007、GL010、GL017、GL026和GL033五株菌株分別接人篩選模型指示因子提取培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基，進行同步篩選培養(yǎng)。耐反饋抑制作用篩選模型試運行結(jié)果與指數(shù)比較試驗結(jié)果的比較見表3。由表3可見，用耐反饋抑制篩選模型選出的強耐反饋抑制作用的菌株與用指數(shù)比較試驗選出的胞外多糖產(chǎn)量最高的菌株是一致的，都是GL033，證明模型可行而且可靠。

2．2靈芝胞外多糖高產(chǎn)菌株的檢出

2．2．1初篩

輸入耐反饋抑制篩選模型的37株出發(fā)菌株菌絲生長情況見表4。由表4可見，其中28株無菌絲生長，即予以淘汰。檢出GL006、GL011、GL018、GL025、GL028、GL029、GL031、 GL033和GL039九株耐反饋抑制作用較強的菌株(即有菌絲生長者)進行復篩。繼續(xù)培養(yǎng)至設(shè)定終點，測定培養(yǎng)醪中胞外多糖的濃度。

2．2．2復篩

所得9株耐反饋抑制作用較強菌株復篩培養(yǎng)基中的胞外多糖總濃度見圖2。由圖2可見，GL029培養(yǎng)基中的胞外多糖濃度最高，即其產(chǎn)胞外多糖能力最強。

2．3 既得靈芝胞外多糖高產(chǎn)菌株 GL029深層發(fā)酵培養(yǎng)基的選優(yōu)

2．3．1正交試驗結(jié)果

用GL029菌株作正交試驗，其正交試驗結(jié)果見表5。由表5中的Dmax值(因子引起的極大偏差)的比較可見：DA>Dc>DB>DD。即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的四因素對GL029胞外多糖產(chǎn)量影響的強度依次為玉米粉、氯化鉀、蛋白胨和硫酸鎂。比較表5中的K值可得：KA2>KAl>KA3；KR2>Ka3>KBt；Kc2>Kc3>Kc1；KDI> Km>KD2，即四因素的最佳搭配為： A2 B2 C2D1。

2．3．2試驗結(jié)果單因素分析

以不同濃度的玉米粉、蛋白胨、KCl和MgS04作為單因素，其對靈芝胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3～圖6。

由圖3可見，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適量的玉米粉可以提高靈芝胞外多糖產(chǎn)量，但過量的玉米粉會降低靈芝胞外多糖產(chǎn)量，這可能是玉米粉添加量太大，導致培養(yǎng)基過稠，溶氧下降，不利于菌絲生長和靈芝胞外多糖的產(chǎn)生。在提取靈芝胞外多糖時發(fā)現(xiàn)，添加玉米粉30g／L的培養(yǎng)基比添加玉米粉15g/L的培養(yǎng)基要稠，其菌絲濃度也不如玉米粉濃度較低者。

由圖4可見，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適量的蛋白胨作為氮源，可提高靈芝胞外多糖產(chǎn)量，如果添加過量，會導致靈芝胞外多糖產(chǎn)量下降，這可能是因為氮源過于豐富，導致菌絲瘋長，而不利于靈芝胞外多糖產(chǎn)量的提高，只有碳氮比合適的培養(yǎng)基才有利于目標代謝物質(zhì)的積累。

由圖5可見，基礎(chǔ)培養(yǎng)基要維持一定濃度的K+，才有利于提高靈芝胞外多糖的產(chǎn)量。

由圖6可見，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加硫酸鎂對靈芝胞外多糖的產(chǎn)量有影響，但影響不大。雖然鎂和硫是菌絲生長必需的，可影響胞外多糖的產(chǎn)量，但在本試驗中，可能是基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母浸膏和因素A(玉米粉)中含有的鎂和硫已足以滿足胞外多糖合成的需要，所以添加的硫酸鎂對胞外多糖產(chǎn)量影響不大。

單因素分析結(jié)果與表5中Dmax值的比較結(jié)果一致。

四因素對胞外多糖產(chǎn)量影響的方差分析見表6。由表6可見，a=O．10時，四個因素對胞外多糖產(chǎn)量的影響皆顯著；α=O．05時，A、B、C三個因素對胞外多糖產(chǎn)量的影響顯著；a=O．01時，只有A、C二個因素對胞外多糖產(chǎn)量的影響顯著。

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的四因素最佳搭配水平是A2 B2C2D1，即玉米粉15∥L，蛋白胨2g/L，Ka 0．5g/L，MgS040g/L。本研究的9個試驗未采用四因素的這一水平搭配，因為正交試驗僅僅選做一部分因素水平搭配[15]。在采用水平搭配A2B2D1的5號試驗中，靈芝胞外多糖產(chǎn)量高達3．05g/L。結(jié)合本試驗基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方綜合考慮可見，組合碳源和組合氮源比單一碳源和單一氮源更有利于提高靈芝胞外多糖的產(chǎn)量。所以，菌株GL029用于生產(chǎn)靈芝胞外多糖的最適培養(yǎng)基，即在本試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中添加水平搭配為A2 B2 C2D1的4個因素，其配方為蔗糖10g／L，玉米粉15g／L，蛋白胨2g／L，酵母浸膏1g/L，Ka 0．5g/L， KH2P04?7H20 0．5g/L，水1000mL，pH自然。將GL029菌株接入以此配方配制的培養(yǎng)基，于30℃、裝量100mL／500mL、搖床轉(zhuǎn)速120r／min搖瓶培養(yǎng)9d，該菌株的胞外多糖產(chǎn)量達3．07g/L。高于正交試驗中5號試驗的產(chǎn)量．表明本優(yōu)化研究結(jié)果可信可靠。

3討論

3．1本研究首次應用靈芝胞外多糖的反饋抑制作用原理-1¨構(gòu)建了耐反饋抑制篩選模型，并用該模型從37株靈芝菌株中篩選出一株強耐自身代謝產(chǎn)物胞外多糖反饋抑制、高產(chǎn)胞外多糖的靈芝菌株GL029。本研究所構(gòu)建的模型不僅為選育用于深層發(fā)酵的靈芝優(yōu)良菌株提供了新的途徑，而且大大提高了選育菌種的效率。

3．2本研究對既得耐胞外多糖反饋抑制作用的靈芝菌株GL029的深層發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，組合碳源和組合氮源比單一碳源和單一氮源更有利于提高靈芝胞外多糖的產(chǎn)量。以最適配方培養(yǎng)基，起始pH自然，培養(yǎng)溫度30℃，裝量100mL／500mL，搖床轉(zhuǎn)速120r／min培養(yǎng)9d，該菌株的胞外多糖產(chǎn)量達3．07g/L，高于目前國內(nèi)文獻報道的最高產(chǎn)量2．91g/ L[16]。

3．3本試驗已對既得菌株GL029進行了搖瓶培養(yǎng)基優(yōu)化，其發(fā)酵罐發(fā)酵工藝過程控制及其優(yōu)化則有待進一步研究。

參考文獻

[1]林志彬．靈芝的現(xiàn)代研究[M]．北京：北京醫(yī)科大學出版社，2001．

[2]何云慶，李榮芷，蔡廷威，等．靈芝糖肽的化學研究[J]．中草藥，1994，25(8)：395 397．

[3]黃芳，蒙義文．活性多糖的研究進展[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1999，11(5)：90--98．

[4]Jiri Patocka．Anti-inflammatory triterpenoids from mysterious mush_rg~m Ganoderma lucidum and their potential possibility inmodern medicine【J】．Acta Medica，1999，42(4)：123～125．

[5]馬禮金，姚汝華．靈芝的藥用及食用研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，1997，24(1)：62--66．

[6]Kim SW,Hwang HJ，Park JP，et a1．Myeelial growth and exo-biopolymer produetiDn by submerged culture 0f various edible mushrooms under different media[J]．Letters in Applied Microbiology，2002，34(1)：56--60．

[7]方慶華，鐘建江．靈芝真菌發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸[J]．華東理工大學學報(自然科學版)，2001，27(3)：254--257．

[8]羅立新，周少奇，姚汝華．靈芝菌誘變育種與深層培養(yǎng)的研究[J]．工業(yè)微生物，1998。28(3)：10～14．

[9]LiSun。Huaqingcai，WeihongXu，et a1．Efficient transformationofthemedicalmushroomGanoderma lucidium[J]．Plant MolecularBiologyReporter，2001，19：383a--383j．

[10]楊焱，周昌艷，馮志勇，等．深層發(fā)酵靈芝高產(chǎn)菌株篩選初探[J]．食用菌學報，2002，9(4)：18～21．

[11]宋頻然，常繼東．靈芝真菌發(fā)酵胞外多糖反饋抑制的初步研究[J]．華東理工大學學報(自然科學版)，2003，2(3)：311～314

[12]李曉暉，李書平，何云慶，等．靈芝多糖的含量測定研究[J]．中草藥，1997，28(9)：530--531．

[13]張惟杰．復合多糖生化研究技術(shù)[M]．上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1987．81--86．

[14]于寅．高等工程數(shù)學(第二版)[M]．武漢：華中理工大學出版社，1995．

[15]上海市科學技術(shù)交流站．正交試驗設(shè)計法――多因素試驗的試驗方法[M]．上海：上海人民出版社，1975．

[16]李平作，徐柔，章克昌．靈芝胞外多糖深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]．無錫輕工業(yè)大學學報，1998，17(4)：28--30．