雙孢蘑菇菌種選育的主要方法有兩種。第一，通過(guò)比較篩選來(lái)獲得具有優(yōu)良性狀的菌株；第二，在菌株間進(jìn)行雜交來(lái)產(chǎn)生并利用新的變異。育種者的目標(biāo)是要把控制重要商品性狀的基因組合在一起，以獲得既高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)又抗病的商品菌株。

一、雙孢蘑菇菌種選育進(jìn)展

　　自有人工栽培雙孢蘑菇以來(lái)，菌株選育的方法得到不斷的發(fā)展。大約在1700年以前， 人們就已經(jīng)在戶外， 比如馬廄或牛馬車經(jīng)過(guò)的路旁采集蘑菇菌種。Abetcrombic(1779)報(bào)道說(shuō)：馬糞菌種可以根據(jù)其具有強(qiáng)烈蘑菇氣味的特性來(lái)識(shí)別。用這種方法獲得的菌種，可靠性差。十八世紀(jì)九十年代法國(guó)人使用試驗(yàn)室萌發(fā)的蘑菇孢子制種取代了從自然引種，這方法傳進(jìn)了美國(guó)，Lambert于1929 年提出子實(shí)體能從單孢子萌發(fā)的菌絲體產(chǎn)生，并公開了用蘑菇孢子和組織培養(yǎng)物制種的秘密，促進(jìn)了選種工作的開展。早期的選種方法基本采用多孢分離，但改良菌株的進(jìn)程緩慢，Sinden(1981)敘述了他采用多孢篩選法獲得A6菌株的經(jīng)過(guò)，他前后經(jīng)過(guò)近三十年的努力，但A6也不是十分理想的菌株。我國(guó)過(guò)去采用多孢篩選法前后約有三十年，但始終沒(méi)有留下明顯進(jìn)步的菌株，這和我國(guó)把選種作為制種的一個(gè)程序，年年選，年年棄，沒(méi)有把良種留下有關(guān)。然而多孢篩選法，在遺傳上均一性大于變異性，理論上難于獲得具有明顯性狀的變異株。要有效地選育新菌株，得尋找別的方法。

　　單孢分離篩選比多孢篩選具有更大的機(jī)率獲得明顯性狀的新菌株。盡管單孢分離是一種費(fèi)時(shí)的工作，但采用此法，確能獲得比較好的菌株 ( Fritsche ， 1972;Kneebone et al，1976)。福建省輕工業(yè)研究所于1983 年后從一些菌株中分離了近千個(gè)單孢培養(yǎng)物，獲得了10株具有較好種性的新菌株，其中"閩一號(hào)"菌株曾在省內(nèi)外廣泛使用。

　　雖然多孢分離和單孢分離選種曾經(jīng)為雙孢蘑菇商業(yè)性栽培提供了許多重要的菌株，但是這些菌株仍然存在難以克服的缺點(diǎn)，就是高產(chǎn)的菌株常常不優(yōu)質(zhì)，而優(yōu)質(zhì)的菌株常常不高產(chǎn)，單產(chǎn)甚至只達(dá)高產(chǎn)菌株的一半。為了選育兼具高產(chǎn)與優(yōu)質(zhì)特性的菌株，育種家很自然地著眼于雜交方法的研究。雜交在動(dòng)植物育種中的應(yīng)用已有長(zhǎng)久的歷史而且取得巨大的成就，為什么在雙孢蘑菇育種中遲遲沒(méi)有實(shí)現(xiàn)呢？在技術(shù)上有兩個(gè)障礙，一是雙孢蘑菇遺傳特性特殊， 大多數(shù)孢子是自身可育的。 時(shí)至1980年，Sinden在第二次北美蘑菇會(huì)議上還說(shuō)“雜交既無(wú)可能，又很困難……”并認(rèn)為“自從Lambert博士指出蘑菇完全可以用單孢子培養(yǎng)進(jìn)行自體繁殖以來(lái)， 關(guān)于雜交的種種希望已經(jīng)變得暗淡起來(lái)”。第二個(gè)障礙是如何鑒別雜種。對(duì)蘑菇遺傳系統(tǒng)的深入研究，指導(dǎo)著蘑菇選育種工作的進(jìn)展。1980 年荷蘭 Horst 蘑菇試驗(yàn)站的Fritsche利用蘑菇不育單孢子培養(yǎng)物配對(duì)，以恢復(fù)可育性為標(biāo)記選育雜交菌株，使雜交技術(shù)切實(shí)可行，于1981年首先育成純白色蘑菇品系和米色蘑菇品系間雜交的品種U1和U3，并在歐洲廣泛使用。隨后，各國(guó)蘑菇育種者也相繼推出雜交菌株( 王賢樵，1990;王澤生等，1991)。目前生產(chǎn)用種幾乎已全被雜交菌株取代。

　　至于如何鑒別雜種呢？總的說(shuō)是要使用于雜交的親本具有某種遺傳標(biāo)記。1972年Raper等提出利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，1978年 Elliott 利用菌株的抗藥性為標(biāo)記，1982年Royse和May提出應(yīng)用同工酶作為雜交標(biāo)記。1988年Castle等利用DNA的RFLPs多態(tài)性為標(biāo)記。1992年，Khush等，1994年， 福建省輕工業(yè)研究所與廈門大學(xué)合作研究利用DNA的RAPD多態(tài)性為標(biāo)記。其中，同工酶標(biāo)記和RAPD標(biāo)記被廣泛采用。

　　最近幾年利用生物原生質(zhì)體融合再生育成雜種的技術(shù)在雙孢蘑菇育種工作中的應(yīng)用研究也有了開端，這給種間雜交帶來(lái)可能性。我國(guó)許多單位也在研究種間雜交的技術(shù)。原生質(zhì)體技術(shù)還被應(yīng)用于獲得同核體(Castle，1988;Wang，1990)。 分子生物學(xué)的進(jìn)步在育種上發(fā)展了基因工程，把人們需要的一個(gè)或幾個(gè)基因片段從一個(gè)細(xì)胞分離提取出來(lái)，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)細(xì)胞中去，使外來(lái)的基因整合到受體細(xì)胞DNA上，改變了受體細(xì)胞的遺傳信息，無(wú)疑，這將給育種家開辟出廣闊的前景，育成雙孢蘑菇理想的菌株，為時(shí)將不會(huì)太遠(yuǎn)。

　　目前，同核不育單孢配對(duì)雜交仍然是雙孢蘑菇育種的有效方法，但產(chǎn)生的雜種子代并不都具備親本的優(yōu)良性狀。為此，育種者不但要求能鑒定雜交，更希望能迅速有效地育成優(yōu)良的雜交菌株，這就需要尋找與種性相關(guān)的標(biāo)記并探索雜交菌株的遺傳規(guī)律，。1987年，王賢樵和王澤生提出應(yīng)用同工酶電泳法預(yù)測(cè)雙孢蘑菇菌株的特性。1990年，王澤生等提出雙孢蘑菇雜種子一代與子二代遺傳變異的酯酶同工酶模式。指導(dǎo)育成的雜交菌株AS2796系列已在全國(guó)推廣使用。

 

二、雙孢蘑菇育種的目標(biāo)

　　從三百年來(lái)雙孢蘑菇選育種技術(shù)的演變，看到了育種家辛勤的勞動(dòng)，那么育種家追求的目標(biāo)是什么呢？Fritsche(1981)說(shuō)：“過(guò)去，首要的是提高單產(chǎn)，而現(xiàn)在先決的是提高質(zhì)量，這在將來(lái)仍然如此，因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)更加激烈。”

　　1981年May提出：“在植物育種方面作任何嘗試之前， 育種家要在頭腦里牢固地建立所需菌株的模式。”一種理想模式菌株的指標(biāo)：子實(shí)體應(yīng)是白色的、光滑的、對(duì)稱的、成比例的、結(jié)實(shí)的。菌蓋直徑在3.0-5.0cm之間，大小均勻， 菌株高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，對(duì)大多數(shù)病蟲害具有高水平的抵抗能力并且有較長(zhǎng)的貨架壽命。

　　１、白色：隨著鮮菇市場(chǎng)的發(fā)展，蘑菇栽培者將隨消費(fèi)者的喜愛(ài)而栽培白色的品種。

　　２、菌蓋光滑：對(duì)消費(fèi)者說(shuō)，雖然稍有鱗片的品種是可以接受的，但大多數(shù)消費(fèi)者似乎更喜歡表面光滑的品種。

　?。?、菌蓋對(duì)稱：從上面看時(shí)，菌蓋應(yīng)呈勻稱圓形，從側(cè)面看時(shí)，菌蓋應(yīng)呈微凸形的冠狀。

　　４、菇形成比例：菌蓋和菌柄的比例必須符合審美觀的要求，一個(gè)好看的蘑菇應(yīng)具有不會(huì)太細(xì)、太長(zhǎng)，也不會(huì)太短太粗的菌柄。

　?。?、菇體結(jié)實(shí)：結(jié)實(shí)說(shuō)明菇體密度大，菌蓋和菌柄應(yīng)是緊密的而不是海綿狀的或空心的。

　?。丁⒋笮∵m中：菌蓋均勻，直徑在3.0-5.0cm之間的蘑菇采收快， 處理方便，受消費(fèi)者歡迎。然而，某些市場(chǎng)喜歡更大或更小的蘑菇。

　?。?、對(duì)病蟲害的抵抗力：選育對(duì)病蟲害有抗性的品種幾乎是所有植物育種者的一項(xiàng)主要工作，需要把抗病害，特別是抗輪枝霉病的抗性結(jié)合在理想品系中。

　?。?、更高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)：選育一株對(duì)環(huán)境適應(yīng)性更廣，生物效率更高的栽培種是必要的。這個(gè)目標(biāo)包括需要更好地了解限制產(chǎn)量這個(gè)因素的遺傳機(jī)制。

　?。?、具有較長(zhǎng)的貨架壽命：選擇具有較長(zhǎng)貨架壽命的蘑菇品系可能是增加經(jīng)濟(jì)效益有效的方法，一些因素如氧化速率、顏色變化速率、重量減輕速率等均影響蘑菇的貨架壽命。

　　在我國(guó)，大部分蘑菇是用于罐藏加工，理想的菌株除了基本符合以上提出的指標(biāo)之外，尚要重視菌褶大小和顏色。菌褶顏色太深，在罐藏加工之后，特別是制成片菇或碎菇，菌褶發(fā)黑，菌蓋切面灰暗，是感觀評(píng)定的大忌，此外，菇體是否結(jié)實(shí)也反映到加工原料噸耗的高低，也將直接影響加工的原料成本。

 

三、雙孢蘑菇同核不育單孢配對(duì)雜交定向育種

　　雙孢蘑菇選育種技術(shù)與方法經(jīng)歷了自然采種、純種培養(yǎng)、組織分離保種到多孢子分離和單孢子分離選種，曾經(jīng)為雙孢蘑菇商業(yè)性栽培提供了許多重要菌株。隨著對(duì)雙孢蘑菇遺傳規(guī)律的深入了解和生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，雜交成為全世界當(dāng)前改良蘑菇品種的重要手段。不同類型商業(yè)菌株混合培養(yǎng)的方法，難以產(chǎn)生、發(fā)現(xiàn)雜交種。同核不育單孢配對(duì)雜交是當(dāng)前使用最廣泛的方法。原生質(zhì)體融合作為蘑菇種內(nèi)育種手段，主要是強(qiáng)制配對(duì)培養(yǎng)不親和組合發(fā)生雜交，作為種間雜交育種（比如雙孢蘑菇與大肥菇雜交）仍處于研究階段。DNA 水平的目的基因轉(zhuǎn)化育種目前還處于基礎(chǔ)理論研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立的時(shí)期，離應(yīng)用尚有一段時(shí)間。下面主要介紹同核不育單孢配對(duì)雜交技術(shù)。雙孢蘑菇同核不育單孢配對(duì)雜交的程序可由下圖表示。

 

雙孢蘑菇種質(zhì)的收集

↓

種質(zhì)的親緣關(guān)系與農(nóng)學(xué)性狀分析、鑒定

↓

選出具最小遺傳相似值又各具相對(duì)優(yōu)良性狀的組合

↓ ↓

親株１←─遺傳標(biāo)記─→親株２

　 ↓ ↓

同核不育單孢1 　　　　同核不育單孢2

↓ ↓

在平皿培養(yǎng)基上配對(duì)培養(yǎng)

↓

從菌落接觸區(qū)域分離菌絲體

↓

菌絲尖端分離、培養(yǎng)

↓

遺傳標(biāo)記鑒定雜種F1，預(yù)測(cè)菌株特性

↓

栽培試驗(yàn)，選優(yōu)

↓

進(jìn)行F2單孢分離，預(yù)測(cè)菌株特性

↓

栽培試驗(yàn)，選優(yōu)

圖5-6 雙孢蘑菇同核不育單孢配對(duì)雜交育種程序

 

福建省輕工業(yè)研究所從1983年以來(lái)以酯酶同工酶電泳多態(tài)性為遺傳標(biāo)記，建立了鑒定菌株的基因型、分析菌株間的親緣關(guān)系、推定同核體不育株、鑒定雜交、預(yù)測(cè)新菌株特性、分析雜交菌株子代遺傳變異規(guī)律的一整套技術(shù)。結(jié)果表明酯酶同工酶分析是一種快速、有效且成本低廉的遺傳標(biāo)記技術(shù)，一般大專院校與科研院所均能開展。

（一）種質(zhì)收集、鑒定與親緣關(guān)系分析

　　充分地收集雙孢蘑菇的種質(zhì)，包括栽培菌株和野生菌株，建立種質(zhì)庫(kù)乃至構(gòu)建基因文庫(kù)對(duì)于蘑菇選育種是至關(guān)重要的。

　　通常都認(rèn)為蘑菇栽培起源于法國(guó)，傳到北美，然后擴(kuò)散到世界各地。僅有歐洲（法國(guó)等）和北美（美國(guó)加州）有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)并利用了雙孢蘑菇野生種質(zhì)。據(jù)說(shuō)在我國(guó)新疆、山西、安徽的野地里也發(fā)現(xiàn)過(guò)雙孢蘑菇，但是到目前為止仍未真正獲得野生種質(zhì)(王澤生，1993)。為了充分收集、利用極其有限的蘑菇種質(zhì)，Kerrigan博士于1988年發(fā)起了全球性收集鑒定蘑菇種質(zhì)的計(jì)劃(ARP)，獲得了各地的響應(yīng)。

　　收集來(lái)的蘑菇種質(zhì)材料可以是孢子或子實(shí)體組織分離培養(yǎng)物，它們可以用多種方法予以保藏（將在第四章闡述）。蘑菇種質(zhì)類型的叫法多樣，有分為栽培菌株與野生菌株的，有分為雙孢菌株和四孢變種的，有分為棕色菌株、淺棕色菌株、奶油色菌株、米色菌株和白色菌株的，也有分為匍匐型菌株、氣生型菌株和中間型菌株。蘑菇種質(zhì)的鑒定可以用同工酶電泳(Royse等，1982; 王澤生等， 1989) 、 DNA 的RFLPs(Castle，1988)和RAPD(曾偉等，1997)方法進(jìn)行， 用聚類統(tǒng)計(jì)方法分析菌株間的遺傳相似性及種群間存在的遺傳差異性(圖3-7)。 一些生物統(tǒng)計(jì)軟件上也配備有聚類分析程序。

 

圖3-7?。常箓€(gè)雙孢蘑菇白色菌株的遺傳相似程度系統(tǒng)樹

　　以同工酶電泳區(qū)帶的遷移率(Rm)為依據(jù)比較分析同工酶類型差異、推定基因型變異。把表型完全一致的菌株歸于同一基因類群。二基因類群間的遺傳相似程度值S=NS/NS+ND。NS代表Rm值相同的酶區(qū)帶數(shù)，ND代表Rm值不同的酶區(qū)帶數(shù)。當(dāng)比較的酶多于一種時(shí)，取各遺傳相似值的平均數(shù)作二基因類群間的總遺傳相似值?；蝾惾洪g的遺傳相似程度系統(tǒng)樹的計(jì)算與繪制用類平均聚類法，把遺傳相似值最相近的基因類群組合成新類群，再計(jì)算該類群與其他類群間新的遺傳相似值，進(jìn)一步把最相似的類群組合在一起，直到所有類群配成一個(gè)家系為止。以系統(tǒng)樹反映菌株間的種內(nèi)親緣關(guān)系。

　　從世界各地收集、鑒定、保藏蘑菇菌株所發(fā)表的資料來(lái)看，雙孢蘑菇的種質(zhì)資源十分有限，種質(zhì)庫(kù)里現(xiàn)存的遺傳差異性也較小。

（二）菌株特性預(yù)測(cè)

　　經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工栽培，人們對(duì)雙孢蘑菇的種性有了較多的了解。福建省輕工業(yè)研究所根據(jù)栽培特性、鮮菇質(zhì)量和罐藏加工表現(xiàn)差異，把雙孢蘑菇菌株大致分為高產(chǎn)類型、易褐變類型、中產(chǎn)類型、優(yōu)質(zhì)類型和不育類型（表3-1）。但是， 一個(gè)新引進(jìn)、新分離或新雜交培育的菌株，播種后能否結(jié)菇？質(zhì)量怎樣？是否高產(chǎn)？以前，只能靠多次、大量的栽培觀察，對(duì)比篩選來(lái)直觀評(píng)定，假如能從分子水平找到某種可以用于實(shí)驗(yàn)室早期預(yù)測(cè)新菌株的栽培特性與產(chǎn)、質(zhì)量性狀的指標(biāo)，將大大減輕篩選壓力，提高選育種的效率。

表3-1　雙孢蘑菇不同類型菌株的特性

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高產(chǎn)類型：　　單產(chǎn)與菇潮　結(jié)菇早，一、二潮菇集中、高產(chǎn)

　　　　　　　菌蓋與菌柄　蓋扁平，有時(shí)凹頂，有鱗片，柄髓部松軟，

　　　　　　　　　　　　　菌環(huán)明顯

　　　　　　　菌褶與顏色　菌褶大，菌褶和周圍組織褐色或紅褐色。

　　　　　　　罐藏質(zhì)量　　組織松軟，菌褶和周圍組織色灰暗，菌蓋

　　　　　　　　　　　　　和菌柄空心，高收縮率。

優(yōu)質(zhì)類型：　　單產(chǎn)與菇潮　結(jié)菇較遲，菇潮均勻，較低產(chǎn)。

　　　　　　　菌蓋與菌柄　蓋圓整，柄粗短，光滑無(wú)鱗片，組織致密。

　　　　　　　菌褶與顏色　菌褶小，肉色或淡粉紅色。

　　　　　　　罐藏質(zhì)量　　組織致密，色淡黃，風(fēng)味好，低收縮率。

中間類型：　　單產(chǎn)與菇潮　結(jié)菇早，菇潮明顯，產(chǎn)量中等。

　　　　　　　菌蓋與菌柄　蓋圓整，光滑，時(shí)有菌環(huán)，組織密度中等，

　　　　　　　　　　　　　柄中等粗，常有小菇、薄菇。

　　　　　　　菌褶與顏色　菌褶大小中等，顏色旦粉紅或淺褐色

　　　　　　　罐藏質(zhì)量　　組織密度中等，色淡黃或偏土黃，收縮率

　　　　　　　　　　　　　高或中等

易褐變類型：　單產(chǎn)與菇潮　結(jié)菇早、菇潮明顯，非常高產(chǎn)。

　　　　　　　菌蓋與菌柄　蓋厚，較圓整，有菌環(huán)，柄直細(xì)，組織密度中等。

　　　　　　　菌褶與顏色　菌褶較大，呈褐色或褐紅色并蔓延至周圍組織。

　　　　　　　罐藏質(zhì)量　　菌褶與菌蓋組織深灰色，收縮率高或中等，

　　　　　　　　　　　　　罐藏質(zhì)量差。

不育類型：　　菌絲生長(zhǎng)緩慢，細(xì)弱，不結(jié)菇。

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　　眾所周知，酶是基因的直接產(chǎn)物，又是性狀表現(xiàn)的調(diào)控者。因此，可以設(shè)想菌株特性明顯不同的雙孢蘑菇菌株之間在某些同工酶遺傳基礎(chǔ)上存在差異。福建省輕工業(yè)研究所對(duì)150 個(gè)從國(guó)內(nèi)外收集的各類型菌株作了酯酶等同工酶電泳檢測(cè)分析，把特定區(qū)帶定為標(biāo)記區(qū)帶，把具相同標(biāo)記區(qū)帶的同工酶類型歸于同一大類型，再和菌株栽培表現(xiàn)類型相比較，發(fā)現(xiàn)同工酶電泳表型與菌株特性表型存在著相關(guān)性（表3-2）。荷蘭的Neut(1991) 也把酯酶同工酶電泳表型多態(tài)性用作為菌株特性鑒定和育種檢驗(yàn)的指標(biāo)。

表3-2　雙孢蘑菇菌株特性和酯酶同工酶電泳表型

* 可劃歸為H大類型

（三）同核不育單孢菌株的分離、鑒定

　　同核不育單孢分離鑒定的方法有多種。第一，可以用顯微操作器直接從雙孢蘑菇稀有的３孢或４孢擔(dān)子上直接分離單核孢子，這種方法操作難度大且費(fèi)時(shí)。第二，隨機(jī)分離單孢培養(yǎng)物，挑選生長(zhǎng)弱慢的培養(yǎng)物作遺傳標(biāo)記鑒定。第三，在異核親本原生質(zhì)體再生單株培養(yǎng)物中挑選生長(zhǎng)弱、慢的培養(yǎng)物作遺傳標(biāo)記鑒定。第四，使用四孢變種的單孢培養(yǎng)物。

　　王澤生等(1990)用第二種方法，從14個(gè)異核親本中共分離出2578個(gè)單孢培養(yǎng)物，其中生長(zhǎng)弱慢的有374株，占14.5%，經(jīng)同工酶電泳鑒定為S型的共158株，推定為同核不育培養(yǎng)物的約占單孢分離物的6.1%。栽培中S 型培養(yǎng)物大多數(shù)在堆料中定植很慢，生長(zhǎng)弱，或基本不生長(zhǎng)，即使生長(zhǎng)了也基本未見(jiàn)結(jié)菇。同核不育菌株的同工酶表型均表現(xiàn)為一些電泳區(qū)帶缺失，這與用DNA的RFLP及RAPD 分析鑒定同核不育菌株的研究結(jié)果一致。

（四）配對(duì)雜交技術(shù)與雜交種的鑒定

　　配對(duì)雜交要選擇遺傳相似值小，且具有相對(duì)優(yōu)良性狀和不同遺傳標(biāo)記的組合。一旦異核親本選定，即可分離同核不育菌株。通常認(rèn)為用原生質(zhì)體再生法獲得的同核不育株是無(wú)性繁殖的產(chǎn)物，不發(fā)生變異，可直接用于配對(duì)雜交。但用單孢子分離法獲得的同核不育株一定要進(jìn)行遺傳鑒定，因?yàn)閱捂咦邮怯行陨车淖哟?，可能發(fā)生變異。應(yīng)該選擇保持異核親本遺傳標(biāo)記的同核不育株用于雜交。

　　配對(duì)雜交結(jié)果還受到培養(yǎng)基的影響。有報(bào)導(dǎo)(王澤生等，1990)同一配對(duì)組合在不同的培養(yǎng)基上配對(duì)培養(yǎng)可表現(xiàn)為親和或不親和（表3-3）。 配對(duì)組合的親和性不但受性因子控制也受培養(yǎng)基成份的影響。麩皮培養(yǎng)基或蘑菇堆肥培養(yǎng)基適用于配對(duì)雜交。但仍有一些配對(duì)組合在常規(guī)培養(yǎng)基上不易發(fā)生雜交，此類組合可以用原生質(zhì)體融合法強(qiáng)制雜交(王澤生等，1991)。

表3-3 不同培養(yǎng)基對(duì)同核體配對(duì)雜交親和性的影響

a.培養(yǎng)基Ⅰ-Ⅳ分別為麩皮培養(yǎng)基,PDA,PDA+10%啤酒,PDA+0.1%煙酸;

b.1-5分別代表互相作用區(qū)域菌絲生長(zhǎng)速率由小到大,"0"代表形成拮抗線;

c."+"代表同工酶鑒定菌絲雜交,"-"代表不親和。

圖3-8 雙孢蘑菇同核不育單孢配對(duì)雜交(左邊示親和雜交,右邊示不親和,不能雜交)

　　通常把配對(duì)組合的培養(yǎng)物成對(duì)地接種在培養(yǎng)基上（圖3-8）。 凡二培養(yǎng)物間不形成拮抗線，并產(chǎn)生互相作用的組合記著可能親和。從每個(gè)互相作用區(qū)域均分離３個(gè)菌絲塊，轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天左右，在無(wú)菌室中用顯微操作器鏡檢并用微型打孔器分離數(shù)個(gè)菌絲尖端培養(yǎng)，只有生長(zhǎng)快且有力的分離物供同工酶電泳分析和制種。凡是同工酶電泳出現(xiàn)雜合酶譜的組合均定為真正親和并把其菌絲尖端分離物鑒定為雜種F1，投入栽培檢驗(yàn)可育性。

圖3-9 雙孢蘑菇雜交菌株及其同核與異核親本的酯酶同工酶PAGE電泳圖譜

　　雜交種的同工酶電泳表型基本上表達(dá)了雙親的標(biāo)記區(qū)帶（圖3-9）。 作者在雜交中觀察到有250個(gè)配對(duì)組合發(fā)生了可能親和的現(xiàn)象，從互相作用區(qū)域分離出750個(gè)菌絲塊，經(jīng)菌絲尖端分離，同工酶鑒定有175 個(gè)組合真正親和產(chǎn)生了具有雜合酶譜的異核體雜種F1。投入栽培后，有84個(gè)組合產(chǎn)生的雜種F1恢復(fù)了結(jié)菇能力，對(duì)這種F1菌株還可進(jìn)行單孢分離以獲得重組體。

（五）雜交菌株的使用、變異、復(fù)壯與改良

　　Fritsche的貢獻(xiàn)

Gerda Fritsche 1992年出生于德國(guó)，1957年在漢堡Max Planck 植物育種研究所開始從事蘑菇的研究。1971年來(lái)到荷蘭Horst蘑菇試驗(yàn)站，1991年退休， 從事蘑菇選育種工作三十四年。Fritche 最大的貢獻(xiàn)是利用雙孢蘑菇不育孢子培養(yǎng)物配對(duì)雜交以恢復(fù)可育性為標(biāo)記選育雜種，使雜交技術(shù)切實(shí)可行，于1981年首先育成了U1和U3，使雙孢蘑菇育種技術(shù)發(fā)生了一個(gè)飛躍。在她退休時(shí)，荷蘭Horst 蘑菇試驗(yàn)站籌辦了一次國(guó)際蘑菇科學(xué)會(huì)議并將會(huì)議上發(fā)表的論文編輯成論文集《蘑菇的遺傳與育種》("Genetics And Breeding Of Agaricus")出版， 展示了現(xiàn)代雙孢蘑菇育種技術(shù)的進(jìn)展。國(guó)際蘑菇科學(xué)會(huì)議尊崇她為該會(huì)終生會(huì)員。

U1在生產(chǎn)上的使用

1981年Horst試驗(yàn)站要把U1和U3推向市場(chǎng)，和Darlington 菌種公司聯(lián)合進(jìn)行了謹(jǐn)慎的栽培試驗(yàn)，起初U3表現(xiàn)比U1高產(chǎn)，后來(lái)菇農(nóng)掌握了更不易栽培的U1的栽培技術(shù)，很多菇場(chǎng)轉(zhuǎn)而栽培質(zhì)量更好的U1。Darmycel菌種公司得到允許使用U1，每6 個(gè)月由Horst試驗(yàn)站向Darmycel提供一批新的母種。菌絲體取自堆肥培養(yǎng)物， 另外還保藏在小麥瓊脂斜面上和液氮低溫罐中。

U1的復(fù)壯與改良及其存在的問(wèn)題

1987年發(fā)現(xiàn)U1菌株發(fā)生變態(tài)，如菌蓋趨于扁平，柄和蓋的連接處產(chǎn)生空心使菇蓋易于脫落，單產(chǎn)明顯下降等。 為了使 U1 復(fù)壯， Horst 試驗(yàn)站作了很多努力。Fritsche從那時(shí)起到退休止，幾乎都為了這問(wèn)題而工作，曾經(jīng)采取以下措施:

(1)使用原始兩個(gè)同核體配對(duì)，擬用重建的、表現(xiàn)好的新異核體制作生產(chǎn)用種，沿用"U1"菌號(hào)投放市場(chǎng)，但未獲得理想的重建異核體。

(2)使用原生質(zhì)體克隆再生培養(yǎng)物，仍表現(xiàn)硬開傘、低產(chǎn)。

　　(3)使用U1子二代的多孢培養(yǎng)物，表現(xiàn)不一，有時(shí)單產(chǎn)明顯下降， 有時(shí)轉(zhuǎn)管后產(chǎn)量下降。

(4)使用子二代的單孢培養(yǎng)物，發(fā)現(xiàn)巨大的變異性。

　　以上這幾種嘗試，只有第４個(gè)措施，篩選子二代的單孢培養(yǎng)物，表現(xiàn)出有希望獲得可取代U1的新菌株。雖然子二代的培養(yǎng)物間存在著巨大的變異性，篩選工作量是龐大的。

　　為了獲得更好的菌株，F(xiàn)ritsche還嘗試要結(jié)合U1和白色菌株Le Lion B92 的優(yōu)點(diǎn)而進(jìn)行了U1的改良工作。她把U1子代的不育株和Le Lion B92 子代的不育株進(jìn)行配對(duì)雜交，在161個(gè)組合的子代中篩選，發(fā)現(xiàn)無(wú)一可取，再?gòu)?7個(gè)雜交產(chǎn)物(子一代)收集孢子。每個(gè)樣品大約分離40個(gè)單孢培養(yǎng)物(子二代)，有633 個(gè)單孢培養(yǎng)物參加了篩選，也沒(méi)有獲得理想的菌株， 而分離自另一孢子樣品的單孢培養(yǎng)物， 具有與U1相似的子實(shí)體質(zhì)量，并具更光滑的蓋，然而它們的產(chǎn)量低，為獲得高產(chǎn)株，從這個(gè)孢子樣品繼續(xù)分離單孢子培養(yǎng)物，初步的出菇試驗(yàn)結(jié)果還是令人鼓舞。

存在問(wèn)題的剖析

綜上所述，U1的育成、保種、復(fù)壯和改良可發(fā)現(xiàn)存在以下幾個(gè)問(wèn)題：

　　(1)育種的進(jìn)程單純依靠機(jī)率，以出菇對(duì)比為篩選的唯一手段。

　　(2)為了達(dá)到"復(fù)壯"的目的，進(jìn)行了各種嘗試，在摸索中進(jìn)行，作了許多虛工。

(3)U1的育成是米色與白色兩個(gè)同核體配對(duì)雜交而得的子一代(F1) 所含的兩個(gè)核來(lái)自父本和母本，但未曾經(jīng)過(guò)核配，這或?qū)⒂绊慤1的穩(wěn)定性。

(4)使用原始兩個(gè)同核體配對(duì)，重建的新異核體表現(xiàn)多樣，不能視為U1的復(fù)壯，也不應(yīng)該沿用U1菌號(hào)。

剖析U1菌株育成的方法、保種中的變異和為了復(fù)壯與改良所采取的措施，可以發(fā)現(xiàn)除了以恢復(fù)培養(yǎng)物的可育性為雜交標(biāo)記之外，沒(méi)有涉及雜交菌株的遺傳規(guī)律的探索，以致在育種中僅以子代菌株的表型為取舍的唯一依據(jù)，以出菇對(duì)比為唯一的篩選手段。在菌株發(fā)生變異之后采取的復(fù)壯與改良的措施也缺少理論的指引，只能在摸索中進(jìn)行多種嘗試，而作了許多虛工。

（六）雜交子代的遺傳變異

　　1983年以來(lái)福建省蘑菇菌種研究推廣站建立起同工酶電泳法分析雙孢蘑菇菌株間的親緣關(guān)系、預(yù)測(cè)蘑菇菌株的特性、同工酶電泳推定同核體、同工酶鑒定雜交，構(gòu)建了雜交子一代與子二代遺傳變異的酯酶同工酶(EST)模式。 在雙孢蘑菇雜交育種工作中起了導(dǎo)向的作用。1987年在西德召開的國(guó)際蘑菇科學(xué)會(huì)議上首先展示了雙孢蘑菇不同類型菌株的五種同工酶的垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)表型和U1及U3等菌株的酯酶同工酶的 PAGE 表型。 1990 年又在 Micologia Neotropical Aplicada 等專業(yè)刊物上發(fā)表了“雙孢蘑菇雜交育種技術(shù)研究”“雙孢蘑菇雜交菌株的同工酶表型和菌株特性”等篇論文，引起國(guó)際同行的重視。圖3-10與圖3-11表示雙孢蘑菇傳統(tǒng)菌株及其雜種子一代與子二代遺傳變異的酯酶同工酶(EST) 模式和雙孢蘑菇雜交育種程序。

 

圖3-10 雙孢蘑菇傳統(tǒng)菌株及其雜種子一代(F1)與子二代(F2)遺傳變異的酯酶同工酶(EST)模式。虛線表示出現(xiàn)該變異的機(jī)率很小或尚未發(fā)現(xiàn)。 單實(shí)線表示能夠較經(jīng)常出現(xiàn)該遺傳或變異。雙實(shí)線交叉指向表示能夠通過(guò)配對(duì)雜交獲得所指類型。

　

從世界各地搜集各類菌株

↓

應(yīng)用同工酶電泳法分析菌株間的親緣關(guān)系

↓

選出具有最小遺傳相似值，又各具相對(duì)優(yōu)良性狀的組合

↓ ↓

H型菌株 G型或HG1-2型菌株

↓ ↓

Hs型不育單孢株 同工酶檢驗(yàn) Gs型或HGs型不育單孢株

↓ ↓

在平皿培養(yǎng)基上配對(duì)培養(yǎng)

↓

從親本菌落接觸區(qū)域分離菌絲體

↓

尖端菌絲分離、培養(yǎng)

↓

同工酶鑒定HGx型雜種F1

↓

出菇試驗(yàn)

↓

收孢進(jìn)行F2單孢分離，同工酶電泳預(yù)測(cè)種性

↓

出菇試驗(yàn)

 

圖3-11 酯酶同工酶標(biāo)記指導(dǎo)雙孢蘑菇同核不育株雜交育種程序

 

研究表明H型(米色，高產(chǎn))同核不育株(HS)與G型(白色，優(yōu)質(zhì))同核不育株(GS)配對(duì)雜交，可以獲得G1-5，HG1-2，HG4-5等類型子一代，其中只有HG4和HG5呈典型雜合態(tài)。U1即屬于HG4型。從HG4和HG5 的單孢子二代中幾乎能分離出所有傳統(tǒng)菌株類型(H，HG，G)與多種重組類型(HG6-HG17)、同核不育型(HS，HGS，GS) 和雜合類型(HG4，HG5)。子一代的HG4型和HG5型以及子二代的HG4型和HG5型雜交菌株均可表現(xiàn)出父本和母本的一些性狀，是目前篩選較有希望的類型。

幾年來(lái),以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)深受菇農(nóng)歡迎并得外銷部門和罐頭廠認(rèn)可的雜交新菌株"閩4號(hào)"(As2796)(圖3-12)就是從HG4型雜交子二代中選育出來(lái)的。 該菌株在福建省栽培面積占90%以上，在全國(guó)已累計(jì)推廣2億多平方米，產(chǎn)菇近200萬(wàn)噸,成為全世界推廣栽培最廣泛的雜交菌株之一(王澤生等,1995)。其育成程序如圖3-13所示。

圖3-12 雙孢蘑菇雜交新菌株As2796(中)及其親本菌株02(左),8213(右)

圖3-13 雜交新菌株閩4號(hào)(As2796)育成程序

 

（七）蘑菇育種新技術(shù)與種質(zhì)利用

高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的雙孢蘑菇新菌株的育成依賴于育種技術(shù)的不斷進(jìn)步和種質(zhì)資源的充分利用。

1.同工酶電泳技術(shù)

所謂同工酶是指能催化相同生化反應(yīng)，而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶分子形式。1959年Market用電泳分離法首次發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物的乳酸脫氫酶具有多種分子形式，并將其稱為"isoenzyme"或"isozyme"，即同工酶。至今已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種具不同分子形式的同工酶。

　　檢測(cè)同工酶的技術(shù)， 最廣泛采用的是凝膠電泳法， 有聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)系統(tǒng)，瓊脂糖凝膠電泳(AGE)系統(tǒng)和淀粉凝膠電泳系統(tǒng)等等。電泳方式有臥式平板、垂直柱狀和垂直平板等等。按電泳性質(zhì)又有不連續(xù)系統(tǒng)、SDS系統(tǒng)、 等電聚焦系統(tǒng)等。電泳是利用同工酶具有不同的分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列或組成有差異而引起酶分子帶電，分子形狀、大小等差異，使同工酶在同一電泳系統(tǒng)中具有不同的電荷或不同的電荷數(shù)。又經(jīng)過(guò)凝膠分子篩的過(guò)濾（不連續(xù)系統(tǒng)還有濃縮效應(yīng)），從而分離成遷移率(Rm值)不同的區(qū)帶，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)染色等，顯示出酶譜。酶譜可制成干片歸檔，亦可拍照保存。酶譜的定性分析可通過(guò)Rm值測(cè)量比較進(jìn)行，利用薄層色譜掃描儀，比如CS-930雙波長(zhǎng)薄層掃描儀等，能對(duì)酶譜進(jìn)行定性和定量的自動(dòng)分析處理。

　　因?yàn)橥っ甘腔虻闹苯赢a(chǎn)物，主要是由不同等位基因或不同基因位點(diǎn)編碼的，同工酶的電泳表型是基因型的反映。因此，它不僅是生理生化的指標(biāo)，而且是可靠的遺傳標(biāo)記?？梢猿晒Φ貐^(qū)分種一級(jí)分類單位，也可鑒定未知真菌。以雙孢蘑菇為材料研究或應(yīng)用過(guò)的同工酶類有數(shù)十種，其中應(yīng)用最廣泛的有酯酶(EST)， 乙醇脫氫酶(ADH)，多酚氧化酶(PO)，過(guò)氧化物酶(POD)，肽酶(PEP)等。

同工酶技術(shù)包括3個(gè)方面，即樣品提取，凝膠電泳和染色觀察。

1.1 樣品提取

　　供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，22-25℃培養(yǎng)15-20 天取出用接種刀刮下菌絲按1:3:0.5的比例混合菌絲(g)，0.1M磷酸緩沖液(ml)和石英砂(g)， 置冰浴中研磨成勻漿，4000-10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液，按5:1:1的比例混合上清液，40%蔗糖，和0.01%溴酚藍(lán)溶液，作為電泳樣品置冰箱備用。子實(shí)體取制罐用鮮菇的蓋、褶或柄組織5或10g冰浴研磨成勻漿，以下同菌絲制作。

1.2 電泳:這里主要介紹常用的聚丙烯酰胺凝膠垂直板狀電泳(PAGE)。PAGE 的最大優(yōu)點(diǎn)在于可以通過(guò)選擇單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例，而得到不同孔徑的凝膠，以適合于分離不同分子量、不同結(jié)構(gòu)的酶蛋白。應(yīng)用中多采用不連續(xù)電泳，即通過(guò)濃縮膠的濃縮效應(yīng)和分離膠的篩分效應(yīng)，將同工酶分成一條一條的狹窄的區(qū)帶。分辯率比瓊脂糖凝膠、淀粉凝膠高。

1.2.1 分離膠制備:備好洗滌干凈的垂直板狀電泳槽，裝好膠模，然后制備分離膠。用pH8.9Tris-HCl緩沖液加上Acr-Bis液，TEMED，蒸餾水混勻，再加10%過(guò)硫酸銨，迅速搖勻，灌膠，并用蒸餾水封住膠面，靜置聚合。待聚合完全后，傾出膠體上端的水層，用細(xì)濾紙條吸干膠層上的殘余水跡。分離膠的濃度以9%為宜。

1.2.2 濃縮膠制備:用pH6.7 Tris-HCl緩沖液加上Acr-Bis液，TEMED，蒸餾水， 再加10%過(guò)硫酸銨(或4%核黃素)即搖勻，灌膠于已聚合好的分離膠上，插入樣品?？?，靜置聚合(加4%核黃素要有光照聚合)。

1.2.3 裝槽點(diǎn)樣:拆去樣品?？?，裝槽，注入電泳緩沖液(pH8.3Tris-甘氨酸)， 每個(gè)樣品孔點(diǎn)樣75ul。

1.2.4 電泳:電泳槽置于3℃下120V電泳20分鐘后穩(wěn)壓4小時(shí)左右， 在溴酚藍(lán)指示帶離底部1厘米時(shí)停止電泳。

1.3 染色與觀察

拆下電泳板塊，用蒸餾水邊淋洗邊轉(zhuǎn)移板狀凝膠于染色盤中，傾去蒸餾水，加染色液染色。不同的同工酶的染色配方不同，有的對(duì)溫度、光照等因素還有特別要求，可查閱有關(guān)文獻(xiàn)。現(xiàn)把常用的幾種同工酶染色方法列于表3-4。

表3-4 雙孢蘑菇部分同工酶和水溶性蛋白染色液成份

2.原生質(zhì)體融合技術(shù)

　　在雙孢蘑菇雜交育種中引入原生質(zhì)體技術(shù)有三方面的好處。第一，通過(guò)原生質(zhì)體再生法，可以較快速地獲得同核菌株用于雜交。這種菌株是無(wú)性操作的產(chǎn)物，在遺傳上比有性生殖產(chǎn)生的同核菌株更接近于親本。第二，細(xì)胞壁不親和的配對(duì)雜交組合或親緣關(guān)系相近的蘑菇種間，比如雙孢蘑菇與大肥菇，可以通過(guò)去壁產(chǎn)生原生質(zhì)體，再融合而實(shí)現(xiàn)雜交。第三，原生質(zhì)體還可以作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體。下面介紹雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備、再生與融合的實(shí)驗(yàn)原理、材料與方法、試驗(yàn)結(jié)果與存在問(wèn)題。

2.1　原生質(zhì)體制備

　　把雙孢蘑菇的菌絲體、子實(shí)體組織或孢子置于適合的溶壁酶液中，在適宜的溫度、pH條件下，經(jīng)一定時(shí)間的酶解，降解掉細(xì)胞壁后即可游離出由細(xì)胞膜包圍的球狀體，即原生質(zhì)體。失去細(xì)胞壁保護(hù)的原生質(zhì)體對(duì)滲透壓敏感，低滲下易破裂。因此，原生質(zhì)體形成率受制備材料的類型與生理狀態(tài)、溶壁酶類型與濃度、溶壁酶液的穩(wěn)滲劑類型與濃度及酶解的溫度、pH與時(shí)間等因素的影響。選擇適宜的條件是制備大量的、高活力易再生的原生質(zhì)體的關(guān)鍵。

　　以菌絲體為材料制備雙孢蘑菇原生質(zhì)體包括：菌絲培養(yǎng)、原生質(zhì)體制備、分離、純化與鏡檢幾個(gè)步驟。首先，把雙孢蘑菇菌絲塊接種于裝有液體完全培養(yǎng)基的三角瓶中，在24℃下靜置培養(yǎng)5-10天，把菌絲體取出瀝干，并用0.6MKCl溶液沖洗2遍，用濾紙吸干。按0.5G鮮重菌絲加1ml溶壁酶的比例混合，在24℃下溶解2-6小時(shí)，定時(shí)取樣鏡檢，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體形成率。當(dāng)形成率達(dá)107個(gè)/ml左右時(shí)進(jìn)行提純。原生質(zhì)體懸液經(jīng)G2或G3漏斗過(guò)濾，或300目左右的尼龍網(wǎng)過(guò)濾， 也可用無(wú)菌脫脂棉或玻璃棉絲過(guò)濾。濾液經(jīng)1500rpm離心10分鐘，棄上清液， 沉淀下來(lái)的原生質(zhì)體用等量穩(wěn)滲液稀釋，可重復(fù)離心一次，即得原生質(zhì)體精制懸液。原生質(zhì)體的去壁情況可以加入螢光增白劑等予以檢驗(yàn)(壁成分可染上)，也可以用低滲處理檢驗(yàn)原生質(zhì)體的破裂情況來(lái)初步判定去壁效果。原生質(zhì)體活力檢驗(yàn)可以加0.1%中性紅染色，染上者為失活。

　　有關(guān)研究探討了菌齡、溶壁酶、穩(wěn)滲劑和酶解條件對(duì)原生質(zhì)體形成的影響。

①菌絲菌齡　使用不同菌齡的菌絲制備原生質(zhì)體的結(jié)果差異很大。菌齡太小，生成的菌絲量少、形成率低。菌齡過(guò)大，形成的原生質(zhì)體少而且變形的多，有時(shí)甚至只產(chǎn)生菌絲碎片。以培養(yǎng)5-7天的菌絲制備的原生質(zhì)體形成率高，活力大， 耐精制提純。

②溶壁酶　單一酶對(duì)雙孢蘑菇菌絲體去壁的作用不明顯，多酶混合液的作用亦不理想。目前有效的均為木霉產(chǎn)生的酶系。我國(guó)廣東省微生物所產(chǎn)的溶壁酶，丹麥產(chǎn)的Novozyme234等均屬此類，但效果仍然有別。據(jù)報(bào)導(dǎo)， 復(fù)合酶系中若含過(guò)量的蛋白水解酶等會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而降低原生質(zhì)體活力，并影響到再生(Sonnenberg 等，1988)。

③穩(wěn)滲劑　穩(wěn)滲劑分無(wú)機(jī)和有機(jī)二大類。但同一類型中的不同種類對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響仍然很大，常用0.6MKCl，效果較好。

④酶解條件　適宜的條件是使溶壁酶處于最佳活力狀態(tài)。由于加入的溶壁酶量大，故pH多保持自然，約5-6左右。溫度偏低時(shí)，原生質(zhì)體形成慢，反之快。 但溫度偏高時(shí)，原生質(zhì)體極易破裂，形成率反而下降，雙孢蘑菇以２４℃為宜。酶解時(shí)間以2-4小時(shí)左右形成率高。時(shí)間短，形成率低，時(shí)間太長(zhǎng)， 原生質(zhì)體也易產(chǎn)生變形，活力下降，甚至破裂，形成率亦不高。推測(cè)酶解溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)均易破壞原生質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致變形、破裂。

　　雙孢蘑菇菌絲體酶解后，原生質(zhì)體的釋放不同步且形式多種。在顯微鏡下可觀察到酶解時(shí)，菌絲體發(fā)生了質(zhì)壁分離，其內(nèi)含物劇烈收縮形成明顯的邊界，隨著細(xì)胞質(zhì)的流動(dòng)逐漸從菌絲尖端或側(cè)面釋放出來(lái)，也有從菌絲片段斷面釋放出來(lái)，呈圓球狀（圖3-14）。原生質(zhì)體大小相差較大(4-16微米)，尤其菌絲的菌齡較大時(shí)。偏大的原生質(zhì)體多含大液泡，偏小的多呈透明狀。無(wú)離子水低滲處理后，透明狀的原生質(zhì)體總是最先破裂，其次為含大液泡的原生質(zhì)體，中等大?。ǎ肝⒚状笮。┣覂?nèi)含物較多的原生質(zhì)體可以膨大數(shù)倍于原來(lái)的直徑后才破裂。中性紅染色時(shí)，中等大小的原生質(zhì)體不易染上，表現(xiàn)出較強(qiáng)的活力。推測(cè)偏小的原生質(zhì)體缺少細(xì)胞核或細(xì)胞內(nèi)含物不完整，而偏大且含大液泡的原生質(zhì)體可能是已發(fā)生某種不利的生理變化的結(jié)果。

 

 

 

 

圖3-14 雙孢蘑菇菌絲體制備原生質(zhì)體(1.5%溶壁酶)

　　綜上所述，以菌絲體為材料制備雙孢蘑菇原生質(zhì)體的適宜條件是取幼齡(5-7天)菌絲體加入0.6MKCl配制的1.5%溶壁酶(廣東省微生物所產(chǎn))pH5-6，于24℃下酶解2-4小時(shí)左右，原生質(zhì)體形成率可達(dá)2.4×107/ml。原生質(zhì)體大小較均勻，活力高(王澤生等，1990a)。另有報(bào)導(dǎo)，取４－５天菌齡的菌絲體，以0.6M蔗糖溶液為穩(wěn)滲劑，加入由哈齊木霉Trichoderma harzianum ( TE) 的培養(yǎng)液溶液制備的溶壁酶在 2-4mg/ml濃度時(shí)溶壁活性高，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)1-2 × 10 7 / 克干重菌絲 ( A. S.Sonnenerg等，1988)。

2.2 原生質(zhì)體再生

對(duì)食用菌原生質(zhì)體融合育種來(lái)講，重要的一環(huán)是必須使原生質(zhì)體再生成具細(xì)胞壁的菌絲細(xì)胞。這樣，才能對(duì)產(chǎn)生的同核體或融合子進(jìn)行遺傳鑒別，篩選與利用。

　　原生質(zhì)體再生培養(yǎng)有液體和固體培養(yǎng)兩種形式。一般食用菌多用固體培養(yǎng)基加上原生質(zhì)體包埋（雙層法）效果較理想，常用２％瓊脂作包埋劑，雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生也可用此法。福建省輕工業(yè)研究所所用的方法又有所不同。當(dāng)獲得精制提純的雙孢蘑菇原生質(zhì)體懸液后即把該懸液稀釋成105個(gè)/ml，加0.5ml 于液體再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)(A)， 另取同量原生質(zhì)體樣品加數(shù)倍無(wú)離子水稀釋后加入同一種再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)(B)，分別在24℃下培養(yǎng)，定時(shí)取樣鏡檢再生效果。再生率=(A的原生質(zhì)體出芽數(shù)-B的原生質(zhì)體出芽數(shù))÷加入培養(yǎng)的原生質(zhì)體數(shù)。取適量液體再生培養(yǎng)12-24小時(shí)的原生質(zhì)體懸液涂布于固體再生培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)10-20天， 當(dāng)顯微鏡下觀察到原生質(zhì)體克隆再生成小菌落但尚未與其他克隆相連接時(shí)即用微型打孔器顯微操作分離?？捎镁z生長(zhǎng)速率、菌落形態(tài)、同工酶或核酸電泳等指標(biāo)分析再生結(jié)果。

　　雙孢蘑菇原生質(zhì)體的再生受到再生培養(yǎng)基成份、穩(wěn)滲劑種類與濃度、培養(yǎng)溫度等因素的影響，甚至和制備時(shí)用的溶壁酶種類與濃度、酶解時(shí)間與溫度條件等均有關(guān)系。有些溶壁酶系含有較多的蛋白水解酶，能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而影響再生。酶解時(shí)間長(zhǎng)或溫度高雖然可以在一定程度上提高形成率，但原生質(zhì)體活力受到影響，有些產(chǎn)生變形，甚至破裂，不利于再生。

①再生培養(yǎng)基　雙孢蘑菇在常用的食用菌原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上均難以再生細(xì)胞壁，而在特殊的蘑菇堆料培養(yǎng)基上才獲得５％左右的再生結(jié)果（王澤生等,1990b,c）。這表明雙孢蘑菇的細(xì)胞壁成份或結(jié)構(gòu)與其他食用菌有較大差別，還表明蘑菇堆料中含有適于蘑菇再生細(xì)胞壁的某種成份。

　　原生質(zhì)體于液體再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)１２小時(shí)到２４小時(shí)，萌發(fā)出芽管后再涂布于固體再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)比直接涂布培養(yǎng)更早出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的小菌落，這可能是液體培養(yǎng)狀態(tài)更適于原生質(zhì)體萌發(fā)出芽管的緣故。

②穩(wěn)滲劑　不同的穩(wěn)滲劑成份明顯影響雙孢蘑菇再生率，還影響原生質(zhì)體再生的形態(tài)，不適宜的穩(wěn)滲劑導(dǎo)致原生質(zhì)體呈球狀分裂，甚至不再生出菌絲體。

③顯微觀察　原生質(zhì)體再生過(guò)程的顯微觀察結(jié)果表明，雙孢蘑菇在液體或固體再生培養(yǎng)基上的再生形式相似。Ａ、再生不同步，快的１２小時(shí)后即萌發(fā)出芽管，２４小時(shí)長(zhǎng)成菌絲(圖3-15)，有的已分枝成小菌落狀，慢的２４小時(shí)后才萌發(fā)出芽管。

 

 

 

圖3-15 雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生菌絲體(堆肥培養(yǎng)基)

原生質(zhì)體再生的形態(tài)多種，有的萌發(fā)出芽管即長(zhǎng)成菌絲，有的先分裂出一個(gè)近球狀的細(xì)胞，由此再分出芽管、菌絲，也有的分裂成串珠狀。當(dāng)培養(yǎng)基成份，尤其是穩(wěn)滲劑適宜時(shí)，再生形式以前兩種為主。部分原生質(zhì)體會(huì)不斷膨大，胞內(nèi)液泡也隨之增大，尤其是穩(wěn)滲劑不適時(shí)常發(fā)生。未見(jiàn)這種原生質(zhì)體再生，時(shí)間延長(zhǎng)多破裂。

④同核原生質(zhì)體再生株　應(yīng)用同工酶或核酸電泳技術(shù)分析可以發(fā)現(xiàn)一些雙孢蘑菇異核菌株原生質(zhì)體的再生株是單核或同核體(Castle等，1987;Sonnenberg等，1988)。王澤生等報(bào)導(dǎo)(1990)再生株酯酶同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳表型大多與親本相同，屬于異核體可育株，少部分再生株有區(qū)帶缺失表現(xiàn)，與隨機(jī)分離單孢子獲得的同核體不育株的電泳表型相似。而且，再生的同核體與單孢子分離的同核體在生長(zhǎng)速率與菌落形態(tài)上也有相同特點(diǎn)，即生長(zhǎng)緩慢，菌落形態(tài)與正常的異核體菌株有較明顯差異。這表明可以通過(guò)菌絲原生質(zhì)體再生法獲得同核體株用于常規(guī)雜交，而不必?fù)?dān)心從擔(dān)孢子分離的同核體因經(jīng)歷了減數(shù)分裂而可能發(fā)生某種遺傳變異，或丟失親本的某些優(yōu)良基因(王澤生等，1989)。此法不必通過(guò)栽培收孢，因而又比用單孢子分離篩選同核體更快速、簡(jiǎn)便。但也有報(bào)導(dǎo)，經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體再生的菌株由于曾經(jīng)受過(guò)劇烈的環(huán)境壓力（去壁過(guò)程等）而在菌絲生長(zhǎng)或栽培中表現(xiàn)出某種不良性狀 (Fritsche，1991)。用原生質(zhì)體再生法獲得雙孢蘑菇同核體的頻率一般為10%左右，高的可達(dá)30%(Castle等，1988;廖劍華等，1994)。

　　綜上所述，雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生的較適宜條件是在0.6M蔗糖的堆肥培養(yǎng)基上于24℃下培養(yǎng)10-20天。 液體再生培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)后再涂布于固體培養(yǎng)基上能加快再生菌絲生長(zhǎng)，再生率可達(dá)５％左右。

　　堆肥培養(yǎng)基配方為：堆肥75g，KH2PO42.0g，蔗糖20g，蛋白胨2g，NAA或KT2mg，MgSO4·5H2O0.5g，VB10.5g，壁制劑200ml，水800ml，pH自然。制固體平皿時(shí)加瓊脂20g。壁制劑:稱取靜置液體培養(yǎng)的雙孢蘑菇菌絲體400g，用0.6M穩(wěn)滲液洗滌1- 2次，加500mlpH7.4，0.1M磷酸緩沖液，120℃滅菌30分鐘，濃縮至300ml ， 勻漿，4000rpm離心，獲提取液約200ml。

2.3 原生質(zhì)體融合

雙孢蘑菇雜交中有大約50%的組合因?yàn)榧?xì)胞壁不親和而無(wú)法雜交。 而且與其他食用菌相比，雙孢蘑菇的種質(zhì)資源顯得十分貧乏，與親緣關(guān)系相近的蘑菇種，比如大肥菇等的雜交也存在不親和的問(wèn)題，應(yīng)用原生質(zhì)體融合技術(shù)可以克服這些障礙。

　　常用的食用菌原生質(zhì)體融合方法有化學(xué)融合法和電融合法。檢出融合子常用的標(biāo)記有生態(tài)學(xué)與形態(tài)學(xué)標(biāo)記，有抗性或營(yíng)缺型、同工酶或核酸電泳等遺傳標(biāo)記。福建省輕工業(yè)研究所采用含CaCl2的30%的聚乙二醇(PEG4000)，pH8.5作為融合劑進(jìn)行雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合。融合子經(jīng)過(guò)0.6M甘露醇洗滌以去除PEG毒性后， 置于堆料再生培養(yǎng)基培養(yǎng)10-20天，把肉眼可見(jiàn)的小再生菌落分別移至新鮮的PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，凡菌絲生長(zhǎng)速率恢復(fù)正常的分離株均選出作同工酶檢測(cè)。用酯酶(EST)， 多酚氧化酶(PO)，細(xì)胞色素氧化酶(COD)，過(guò)氧化物酶(POD)和乙醇脫氫酶(ADH) 同工酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)融合子(王澤生等，1991)。凡電泳表型表現(xiàn)出雜合的或互補(bǔ)型的分離株被鑒定為融合株。融合率＝融合株數(shù)÷加入的原生質(zhì)體數(shù)。

　　試驗(yàn)結(jié)果表明，雙孢蘑菇原生質(zhì)體在不同　濃度的PEG-Ca++系統(tǒng)中的凝聚速度不同。例如，當(dāng)用30%PEG時(shí)，Ca++濃度太小，凝聚速度較慢，太大，速度快而且成堆結(jié)團(tuán)。一般用0.02M的CaCl2較好(圖3-16)，原生質(zhì)體融合率可達(dá)10-5-10-6。 同

 

 

 

圖3-16 雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合(30%PEG-0.02MCa++)

親本或不同親本的原生質(zhì)體融合子在堆肥培養(yǎng)基上均可再生。但是，通常只有不同親本的原生質(zhì)體融合成的異核體雜種株才可能恢復(fù)正常的生長(zhǎng)速率。從再生培養(yǎng)15天左右的平皿上挑取的單菌落多屬此類型。同工酶電泳檢測(cè)結(jié)果表明，有的融合株明顯具有雙親的標(biāo)記酶位點(diǎn)，有的呈某一異核親本的表型。與可親和的單核菌絲配對(duì)雜交產(chǎn)生的雜種子一代(Wang等，1990)相比，同工酶表型更加多樣，這可能是原生質(zhì)體融合引起核基因組高頻重組的結(jié)果。經(jīng)栽培試驗(yàn)，結(jié)果表明，并非所有的異核體融合株均恢復(fù)結(jié)菇能力，這種現(xiàn)象與可親和組合單孢株雜交的結(jié)果類似。它暗示細(xì)胞壁親和性與結(jié)菇能力之間并無(wú)必然的關(guān)系，它們可能由不同的位點(diǎn)控制?；謴?fù)結(jié)菇能力的菌株，除部分畸形外，多數(shù)正常。有的融合株明顯結(jié)合了雙親的某些特點(diǎn)。

　　電融合技術(shù)對(duì)原生質(zhì)體損傷小、融合頻率高，還能利用原生質(zhì)體進(jìn)行外源目的基因或細(xì)胞質(zhì)成分導(dǎo)入即轉(zhuǎn)化研究，為加速優(yōu)良種質(zhì)導(dǎo)入蘑菇提供了一條可能的途徑。尋找新的種質(zhì)，采用電融合技術(shù)進(jìn)行雙孢蘑菇與大肥菇種間雜交是福建省輕工業(yè)研究所主要研究?jī)?nèi)容之一。其目標(biāo)是培育出抗蘑菇病毒、耐高溫又保存雙孢蘑菇風(fēng)味的新菌株。

3.基因工程育種技術(shù)

　　基因工程是分子水平上的遺傳工程。主要包括目的基因的標(biāo)記與分離，目的基因與載體連接構(gòu)建新的重組DNA，然后通過(guò)原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或DNA分子雜交技術(shù)等轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和性狀的轉(zhuǎn)移和重新組合，獲得人們所期望的新種。

　　當(dāng)前，應(yīng)用基因工程改良蘑菇品種的主要目標(biāo)有三個(gè)。第一是提高對(duì)栽培基質(zhì)的降解轉(zhuǎn)化能力，提高單產(chǎn)；第二是改良蘑菇的抗病蟲性基因，提高栽培品種的抗病蟲害能力；第三是改良褐變基因，提高鮮菇保鮮能力。

　　應(yīng)用基因工程改良蘑菇品種的技術(shù)、步驟如下：

⑴目的基因分離　分離基因的方法有理化方法或噬菌體攝取法，取得供體細(xì)胞內(nèi)的“目的”基因，或用化學(xué)、酶促方法人工合成“目的”基因。

⑵目的基因的體外重組　這個(gè)過(guò)程需有兩種酶的參與。一種為限制性內(nèi)切酶，是一種水解DNA的磷酸二酯酶。目前主要用分子量小于10萬(wàn)道爾頓限制酶，在Mg2+ 存在下專一性強(qiáng)。另一種為連接酶，用于修復(fù)雙鏈DNA分子上的缺口或裂口， 是通過(guò)合成鄰近核苷酸之間的磷酸二酯酶鏈修復(fù)"缺口"或單鏈DNA的裂口。

　　重組過(guò)程是用特異的限制性內(nèi)切酶切割供體及載體的DNA，所得的DNA片段通過(guò)粘接末端對(duì)應(yīng)堿基間的氫鍵組合到一起，再經(jīng)DNA連接酶的作用，將切口接合起來(lái)，成為一個(gè)完整的重組的DNA分子。

⑶載體傳遞　載體即運(yùn)載基因的工具。體外重組的DNA 分子通過(guò)基因載體進(jìn)入受體細(xì)胞，才能進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。載體傳遞可以通過(guò)細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行，也可以通過(guò)某些噬菌體、病毒或線粒體DNA進(jìn)行。在大肥菇線粒體中發(fā)現(xiàn)有類質(zhì)粒DNA(pl-DNA)，但在蘑菇中尚未發(fā)現(xiàn)，目前有人探討利用蘑菇線粒體DNA作為載體。

⑷轉(zhuǎn)化　有些蘑菇育種者利用基因槍或原生質(zhì)體電融合等技術(shù)把目的基因片段不植入載體而直接轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中進(jìn)行外源基因表達(dá)。

⑸復(fù)制、表達(dá)　基因工程的最后一個(gè)關(guān)鍵在于“目的”基因(重組DNA或外源DNA)在受體細(xì)胞中能復(fù)制而擴(kuò)增，表達(dá)出新的遺傳性狀。

⑹新菌株篩選　重組基因所表達(dá)出的新性狀是否符合要求需要做大量的篩選工作，從大量個(gè)體中篩得具有理想性狀的個(gè)體，才能加以繁殖和利用。

4.雙孢蘑菇育種可利用的其他種質(zhì)

蘑菇屬中許多種產(chǎn)生的子實(shí)體與雙孢蘑菇相似，其中大肥菇(Agaricus bitorqus)最為接近。大肥菇的擔(dān)子上能產(chǎn)生４個(gè)擔(dān)孢子，親和性受單因子控制， 是異宗配合的種。因此，它的單孢子培養(yǎng)物是自體不育的，在它們之間進(jìn)行雜交很容易，由于容易操作，就有可能在較短時(shí)間內(nèi)改良品種。大肥菇野生菌株間存在著巨大的變異，可供利用。另外，大肥菇能在20-30 ℃的高溫下結(jié)菇而且能抗雙孢蘑菇病毒的侵染，假如能把大肥菇的這二個(gè)特點(diǎn)結(jié)合在雙孢蘑菇上，育出的新品種將極大地提高雙孢蘑菇的耐高溫和抗病毒侵染能力。

　　此外，F(xiàn)rische(1979)研究過(guò)野蘑菇(A.arvensis ) 獲得一些進(jìn)展。 Elliott(1979)闡述了大孢蘑菇(A.macrosporus)和雪白蘑菇(A.nivesceus) 都是具有單交配因子、異宗配合的四孢種。大孢蘑菇在栽培雙孢蘑菇的條件下可以結(jié)菇。

　　原生質(zhì)體融合技術(shù)和基因工程技術(shù)為其他種質(zhì)的利用提供了有效的手段。

5.雙孢蘑菇重要標(biāo)記位點(diǎn)研究進(jìn)展

5.1 與雙孢蘑菇交配型性因子和子實(shí)體產(chǎn)生相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)

在改良雙孢蘑菇菌株的特性之前，先了解其生殖體系及其遺傳基礎(chǔ)是十分必要的。遺傳學(xué)家們應(yīng)用了營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變標(biāo)記，抗藥性突變標(biāo)記、同工酶標(biāo)記與 DNA標(biāo)記等進(jìn)行研究，結(jié)果認(rèn)為：雙孢蘑菇的性特征是屬于無(wú)鎖狀聯(lián)合的次級(jí)同宗配合類型，擔(dān)孢子通常是自體可育的； 雙孢蘑菇的性因子屬于二極性， 由一對(duì)性因子A1A2控制。進(jìn)一步的研究表明，雙孢蘑菇的性因子可能存在 A3A4 等復(fù)等位基因 (Raper 等,1972;Elliott 1979;Wang 等,1990)。性因子決定細(xì)胞壁的親和性但并不保證子實(shí)體的發(fā)動(dòng)(Esser，1979;May 等,1982;Wang等,1990)。1990 年加拿大多倫多大學(xué)生物系A(chǔ)nderson教授實(shí)驗(yàn)室開展了染色體與DNA水平上的探討， 已把配合型性因子基本上定位在第I條染色體上， 并進(jìn)一步作配合型性因子與子實(shí)體發(fā)動(dòng)基因的定位，計(jì)劃把這些基因克隆出來(lái)做分子遺傳研究(Xu,加拿大，1990，私人通訊)。此外，Harmsen等(1991)，Wassels(1991)還分別對(duì)雙孢蘑菇2個(gè)連鎖的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因與發(fā)育中的疏水基因進(jìn)行了分離與研究。國(guó)內(nèi)在DNA 水平上的研究剛剛起步。在其他食用菌方面，Meinhardt等人( 1981) 報(bào)導(dǎo)了楊樹菇 ( Agrocybe aegerita)與子實(shí)體發(fā)動(dòng)、發(fā)育有關(guān)的基因Su，fi和fb的研究結(jié)果。Raper等(1991)報(bào)導(dǎo)了一個(gè)誘導(dǎo)裂褶菌子實(shí)體發(fā)育的DNA序列。Shishido(1992) 報(bào)導(dǎo)了與香菇結(jié)實(shí)性相關(guān)的基因結(jié)構(gòu)與功能。總之，在基因水平上的研究仍屬探索，但可望在不久的將來(lái)有較大的突破。

5.2 與雙孢蘑菇降解基質(zhì)能力相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)

一個(gè)菌株降解基質(zhì)的能力直接影響到其產(chǎn)、質(zhì)量性狀的表現(xiàn)。雙孢蘑菇降解基質(zhì)的重要酶類，木質(zhì)素酶（漆酶等），纖維素酶位點(diǎn)始終是蘑菇育種家與生理生化學(xué)家研究的重點(diǎn)。先前，已有人應(yīng)用遺傳型差異與降解基質(zhì)能力的大小評(píng)價(jià)菌株的優(yōu)劣(Kulkarn等，1989)。英國(guó)溫室作物研究所克隆了雙孢蘑菇的產(chǎn)漆酶基因， 并試圖把抗病蟲害基因，降解基質(zhì)的纖維素酶基因，與保鮮相關(guān)的基因，分離鑒定出來(lái)并用于轉(zhuǎn)化育種(Elliott，1988)。

5.3 與雙孢蘑菇產(chǎn)質(zhì)量性狀相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)

尋找能預(yù)測(cè)新菌株產(chǎn)質(zhì)量性狀的標(biāo)記位點(diǎn)，無(wú)疑是蘑菇育種家的重大課題，它不僅能使育種家從成千上萬(wàn)個(gè)新菌株中快速識(shí)別出可能的優(yōu)良菌株，提高育種效率，并能為目的基因的確定與克隆奠定基礎(chǔ)。除了降解基質(zhì)的木質(zhì)素酶、纖維素酶位點(diǎn)與菌株產(chǎn)質(zhì)量性狀相關(guān)外，還有一些重要的酶類，比如雙孢蘑菇的酯酶(EST)、 乙醇脫氫酶(ADH)、多酚氧化酶(PO)、過(guò)氧化物酶(POD)、細(xì)胞色素氧化酶(COD) 同工酶與水可溶性蛋白，這６個(gè)生化標(biāo)記已被證明與不同類型菌株的產(chǎn)質(zhì)量性狀明顯相關(guān)(Wang等，1989a，b)。在有性繁殖的單孢子代中可以發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)質(zhì)量性狀發(fā)生變化的單孢培養(yǎng)物，其同工酶電泳表型也發(fā)生了改變。這些電泳表型因而被命名為H 型或高產(chǎn)類型，G型或優(yōu)質(zhì)類型，HG1-2型或中間類型，S型或不育類型。這些酶當(dāng)中，已知多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶和細(xì)胞色素氧化酶與木質(zhì)素降解或子實(shí)體褐變有關(guān)，而酯酶與乙醇脫氫酶在影響產(chǎn)質(zhì)量性狀中的作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外食用菌界均正在研究之中(Xu等，1990，加拿大私人通訊)。盡管如此，在進(jìn)一步分析HG4-5 型雜交種的單孢子代后，發(fā)現(xiàn)上述6個(gè)生化標(biāo)記，尤其是酯酶的標(biāo)記區(qū)帶(Wang等，1989) 的基因基礎(chǔ)可以被推定。測(cè)算出子代中標(biāo)記位點(diǎn)間重組的頻率，完成了標(biāo)記位點(diǎn)EstA，B與C在染色體上的定位(Wang等，1991)，為定向育種提供了理論預(yù)測(cè)與指導(dǎo)依據(jù)。此外，方自若等(1990)探討了胞內(nèi)核質(zhì)對(duì)金針菇同工酶標(biāo)記位點(diǎn)的影響。朱堅(jiān)等 (1990)試圖尋找早期鑒定高產(chǎn)、抗病、 色淺與質(zhì)脆的金針菇優(yōu)良后代的生化標(biāo)記。三明真菌所王芳輝等(1991)，開展了與香菇某些生長(zhǎng)特征相關(guān)的同工酶研究。李家慎等(1989)，王澤生等(1992)，張金霞等(1992)探討了與草菇種性相關(guān)的同工酶類。荷蘭的Neut(1991)也用酯酶把雙孢蘑菇分為白色品系、米色品系、Horrouda雜交品系和HorWitu雜交品系四大類型，并用作育種的檢驗(yàn)指標(biāo)。 除了雙孢蘑菇的同工酶標(biāo)記位點(diǎn)產(chǎn)物類型已被應(yīng)用于實(shí)際育種中外，其他均處于探索階段。

5.4 與雙孢蘑菇褐變或風(fēng)味相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)

幾乎所有的食用菌子實(shí)體都是生長(zhǎng)快速而又容易腐敗的，雙孢蘑菇也不例外。因而，蘑菇栽培者與加工廠商都希望育種家為他們提供不易褐變、風(fēng)味好、保鮮能力強(qiáng)的優(yōu)良品種。早先，只能單純依靠栽培來(lái)篩選菌株，需花費(fèi)巨大的人力、物力、財(cái)力。后來(lái)引入了同工酶等生化標(biāo)記(Wang等,1989a,b,1992) 以防止栽培生產(chǎn)中使用不符合鮮銷或制罐要求的易褐變或易腐敗的菌株。1988年始,美國(guó)的Monterery研究室的Wach等將荷蘭育種家Fritsche育成的雜交種U1的DNA片段導(dǎo)入大腸桿菌， 建立起基因文庫(kù)，并嘗試把某些DNA片段導(dǎo)入其他菌株， 以期育成不因機(jī)械傷而發(fā)生褐變的優(yōu)良菌株。1991年，Khush等應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增重要的DNA片段， 對(duì)能催化褐變的雙孢蘑菇酪氨酸酶的基因作了研究。

5.5 食用菌基因組文庫(kù)的建立

食用菌基因工程研究的另一內(nèi)容是通過(guò)提取菌株的高分子量總DNA， 經(jīng)酶切和電泳或密度梯度離心，獲得一定長(zhǎng)度(Kb)的總DNA酶切片段，以細(xì)菌質(zhì)粒等為載體，經(jīng)過(guò)酶連形成重組DNA，再轉(zhuǎn)入受體菌中構(gòu)建為基因組文庫(kù)。 進(jìn)一步應(yīng)用分子雜交技術(shù)，從文庫(kù)中篩選特異性基因（目的基因），再應(yīng)用于食用菌遺傳育種等研究之中。八十年代始，國(guó)內(nèi)外開展了這方面的工作。如Esser等于1983 年提出利用線粒體DNA或者類質(zhì)粒作為真核細(xì)胞的載體。Elliott和Noel等(1987)建立了雙孢蘑菇和楊樹菇的基因文庫(kù)。Challen等(1991)提出了雙孢蘑菇轉(zhuǎn)化的策略。Koyer等(1991)展望了雙孢蘑菇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的現(xiàn)狀與未來(lái)。呂作舟等(1992，1993)報(bào)導(dǎo)了平菇基因組文庫(kù)的構(gòu)建。此外，裂褶菌與鬼傘類的基因組文庫(kù)也被構(gòu)建起來(lái)。

　　對(duì)雙孢蘑菇遺傳生活史及其基因基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，從個(gè)體水平，細(xì)胞水平，提高到分子水平，使我們能夠把它們與配合型性因子，控制子實(shí)體發(fā)動(dòng)、發(fā)育，控制降解基質(zhì)能力，與產(chǎn)質(zhì)量性狀相關(guān)或影響子實(shí)體褐變，風(fēng)味的重要標(biāo)記位點(diǎn)作為目的基因來(lái)進(jìn)行研究。上述四個(gè)方面，只要任一方面獲得突破性進(jìn)展都將把雙孢蘑菇的育種技術(shù)真正提高到分子水平，對(duì)改良菌株特性，提高生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益都將產(chǎn)生重大的影響。

6.染色體組型分析及遺傳連鎖圖的建立

脈沖電泳的發(fā)明使得分離染色體、 分析核型成為可能。 Royse( 1991) ，Sonnenberg(1991)，Lodder(1993)先后將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于雙孢蘑菇的研究，并且進(jìn)展很快。應(yīng)用Novozyme234制備原生質(zhì)體的得率可高達(dá)1.6-6.7×109/g干菌體， 滿足進(jìn)行脈沖電泳的制樣需求。在各項(xiàng)參數(shù)被優(yōu)化后的電泳條件下，雙孢蘑菇的核型在電泳膠上表現(xiàn)為11個(gè)條帶，分子量分布在1.1到5.7，基因組總長(zhǎng)約34Mb，進(jìn)一步進(jìn)行Sorthern雜交則確證雙孢蘑菇染色體一共有13條。早在1959年Evans 也曾通過(guò)染色鏡觀察，估計(jì)染色體有9條。

雙孢蘑菇的染色體組型，在各菌株間呈明顯多態(tài)，并且遺傳物質(zhì)在雜交子中是非等量混合的。Kerrigan還發(fā)現(xiàn)同核株的菌絲活力往往與一定染色體片段相關(guān)聯(lián)。應(yīng)用脈沖電泳分離雙孢蘑菇的染色體，配合分析各標(biāo)記在親本及其子代中的分離情況，Kerrigan于1993年建立了包括同工酶、RFLP、RAPD、rDNA重復(fù)序列以及少量外部表型性狀等多種標(biāo)記的遺傳連鎖圖?；旌蠘?biāo)記連鎖圖的建立為今后進(jìn)一步分析雙孢蘑菇的遺傳行為，定位克隆有關(guān)基因提供了一個(gè)很好的參照標(biāo)尺。

脈沖電泳在雙孢蘑菇遺傳研究中的最新發(fā)展是1996年Sonnerberg將從cDNA文庫(kù)中分離得到的表達(dá)序列標(biāo)記(ETS)定位于雙孢蘑菇相應(yīng)的染色體上，其中包括ATP合成酶、漆酶、纖維素酶等已被克隆測(cè)序的與雙孢蘑菇菌絲的生理生化特性相關(guān)基因。Sonnerberg的研究取材為U1菌株的兩個(gè)同核雙親。研究發(fā)現(xiàn)rDNA在染色體中拷貝數(shù)的不同可導(dǎo)致相同的染色體的長(zhǎng)度在不同菌株中發(fā)生變化。這是染色體組型在菌株中呈現(xiàn)多態(tài)性的原因之一。表達(dá)序列標(biāo)記及某些功能基因的定位有利于今后對(duì)這些基因的表達(dá)、調(diào)控作進(jìn)一步深入的研究。

7.mtDNA的遺傳研究

線粒體DNA(mtDNA)是真菌中最主要的染色體外遺傳物質(zhì)，遺傳方式獨(dú)特。該遺傳系統(tǒng)雖受控于核系統(tǒng)，但仍存在特殊的DNA復(fù)制機(jī)制，RNA拼接機(jī)制以及個(gè)別有別于"通用"密碼子的遺傳密碼子。

對(duì)雙孢蘑菇mtDNA的研究始于1988年，此年Hintz構(gòu)建了雙孢蘑菇的mtDNA 的物理圖譜。發(fā)現(xiàn)的雙孢蘑菇的大小為136Kb，是在真菌中發(fā)現(xiàn)的分子量較大的mtDNA。從得到的酶譜來(lái)看，線粒體基因組也同其它的真核生物(尤其真菌)一樣大致可分為可變區(qū)與保守區(qū)，但mtDNA的編碼能力穩(wěn)定， 在種間及種內(nèi)顯現(xiàn)多態(tài)性的原因主要在于基因組內(nèi)含子數(shù)量的變化。另外，所有mtDNA中均存在反向重復(fù)序列， 此類序列有時(shí)雙向存在，暗示雙孢蘑菇mtDNAA 中存在轉(zhuǎn)座行為， 從而導(dǎo)致分子內(nèi)重組 (Sonnerberg等，1991)。

盡管雙孢蘑菇mtDNA在種內(nèi)存在多態(tài)性， 但由于雙孢蘑菇保守的遺傳機(jī)制以及長(zhǎng)期以來(lái)在栽培中標(biāo)準(zhǔn)單一的人工篩選， 其多態(tài)性明顯不如其它許多物種顯著。Sonnerberg等用限制性酶切產(chǎn)生多態(tài)酶譜的方法發(fā)現(xiàn)三種mtDNA ， 即使后來(lái) Jin(1992)再用RFLP標(biāo)記探針雜交，也僅能區(qū)分出四種mtDNA，這是雙孢蘑菇種質(zhì)危機(jī)的另一體現(xiàn)。

mtDNA的遺傳是單親遺傳，不同線粒體DNA的同核株的雜交子只承襲其中一個(gè)親本的基因型，而且往往是生長(zhǎng)得較快親本的線粒體基因型。但如果讓生長(zhǎng)較慢的同核株先生長(zhǎng)一段時(shí)間后，再與生長(zhǎng)較快的同核親本雜交，則在菌絲的融合區(qū)可分離到包含兩親本線粒體基因型的異核子代， 在子代中兩親本的胞質(zhì)分配不均是造成mtDNA單親遺傳的原因之一(Jin，1994)。雜交子中極少發(fā)現(xiàn)有重組型線粒體DNA ，但重組型線粒體DNA可在原生質(zhì)體融合株中發(fā)現(xiàn)，因?yàn)殡娙诤蠈?dǎo)致線粒體融合。 所以從育種角度來(lái)看，原生質(zhì)體融合比單孢雜交更易產(chǎn)生新種。

不同的線粒體DNA之間未發(fā)現(xiàn)有明確的顯隱性關(guān)系， 但以上提到的菌絲融合區(qū)分離到包含兩親本基因型的異核子代在充分生長(zhǎng)后，其中之一的線粒體基因型會(huì)丟失。至今沒(méi)有很好的假說(shuō)來(lái)解釋這一現(xiàn)象，Sonnerberg(1991)曾經(jīng)提出不同核/ 質(zhì)組合可能存在顯隱性關(guān)系的假說(shuō)。

8.雙孢蘑菇轉(zhuǎn)化育種研究進(jìn)展

雙孢蘑菇育種實(shí)踐呈現(xiàn)兩大趨勢(shì)，一是篩選同核單孢或原生質(zhì)體進(jìn)行雜交，期望通過(guò)具抗逆性較強(qiáng)或其它優(yōu)良性狀的野生株與"近乎純種"的商業(yè)株之間的雜交來(lái)提高生產(chǎn)用種的種性，因此發(fā)現(xiàn)更多的野生種質(zhì)形勢(shì)迫切。另一趨勢(shì)則是運(yùn)用原生質(zhì)體為DNA片段的受體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化育種。事實(shí)上， 轉(zhuǎn)化比雜交可更直接地對(duì)雙孢蘑菇的基因組進(jìn)行改造，這種改進(jìn)雙孢蘑菇農(nóng)學(xué)性狀的方法目的性、選擇性更強(qiáng)。原生質(zhì)體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，一般通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，表型互補(bǔ)或顯性標(biāo)記的方法進(jìn)行選擇。但雙孢蘑菇的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株很難獲得，而且突變子由于生理上的缺陷，生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)困難。因此，以抗藥性作為顯性標(biāo)記是轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中較受青睞的方法。

　　技術(shù)上外源DNA片段導(dǎo)入原生質(zhì)體的手段包括⑴PEG/CaCl2介導(dǎo);⑵LiCl 介導(dǎo)，但該法的轉(zhuǎn)化效率不如PEG/CaCl2介導(dǎo)法;⑶電轉(zhuǎn)化;以及⑷用基因槍將DNA直接射入原生質(zhì)體。

　　Sorthern分析和亞克隆試驗(yàn)表明，大多數(shù)絲狀真菌的轉(zhuǎn)化為整合轉(zhuǎn)化，而且轉(zhuǎn)化DNA整合不需要廣泛的序列同源性。整合有同源重組和非同源重組兩種類型。 然而，在雙孢蘑菇中，正如以往的研究發(fā)現(xiàn)的，重組行為極少在該物種中發(fā)生，無(wú)論是核基因組還是線粒體基因組。因此，90年代初期進(jìn)行的雙孢蘑菇原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)鮮有成功的報(bào)導(dǎo)。當(dāng)然，當(dāng)時(shí)這方面的轉(zhuǎn)化技術(shù)尚不完善，采用的是效率相對(duì)較低的PEG/CaCl2DNA片段介導(dǎo)法，而且連接大腸桿菌的抗潮霉素轉(zhuǎn)化載體的pAN7啟動(dòng)子是來(lái)自非蘑菇屬的曲霉。

　　到了90年代中期，荷蘭的Van de Rhee 的努力使原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究有了較大進(jìn)展。雖然轉(zhuǎn)化子選擇標(biāo)記仍以潮霉素(hygromycin)抗性作標(biāo)記，但此時(shí)的轉(zhuǎn)化載體已有了雙孢蘑菇的啟動(dòng)子Abgpd2，終止子為pA2H或pA2H-T1，轉(zhuǎn)化方法改用電轉(zhuǎn)化,載體在轉(zhuǎn)化前用單切酶切成線狀，提高了轉(zhuǎn)化的效率。Van de Rhee 等人還曾嘗試將造成雙孢蘑菇褐變的酪氨酸基因的反義DNA 序列與潮霉素抗性基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，以期抑制子實(shí)體中酪氨酸酶的活性，達(dá)到保鮮的目的。結(jié)果在轉(zhuǎn)化株的子實(shí)體中用探針仍可檢測(cè)到穩(wěn)定存在的導(dǎo)入DNA片段。

　　一個(gè)有價(jià)值的雙孢蘑菇的轉(zhuǎn)化株的獲得必然包括三個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)，外源DNA 片段的成功導(dǎo)入;該片段在受體細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá);以及該基因控制的性狀在子代中的穩(wěn)定遺傳。但目前為止，外源DNA在受體細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)還很難做到， 而且克隆到的直接控制雙孢蘑菇表型性狀的目的基因?yàn)閿?shù)甚微。因此，雙孢蘑菇的轉(zhuǎn)化育種研究仍有許多工作要做。

 

（八）雙孢蘑菇商品雜交菌株簡(jiǎn)介

目前全世界使用的雙孢蘑菇菌種有90%以上均為同核不育單孢雜交的菌株。 從顏色上分，有白色雜交種（多為純白種與米白色種雜交）和棕色雜交種（多為棕色種之間或棕色與白色種之間雜交）。從生產(chǎn)特性上分又有適于工廠化生產(chǎn)的種（如U1系列）或適于自然氣候條件下栽培的種（As2796系列）。從加工特點(diǎn)上分，又有適于鮮銷的種(S130),適于罐藏加工的種及二者都適用的種(As2796)。 現(xiàn)將在我國(guó)已被試種過(guò)的幾種雜交菌株介紹如下。

表3-5 雙孢蘑菇部分商品雜交菌株簡(jiǎn)介

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國(guó)別 選育單位 菌株名稱 EST同工酶類型 使用情況

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中國(guó) 福建省蘑菇 As2796 HG4 在中國(guó)廣泛使用，抗逆性

菌種研究推 As3003 HG4 強(qiáng)，鮮菇適用于罐藏或鮮

廣站 As4607 HG4 銷。

荷蘭 Horst蘑菇 U1 HG4 在歐洲，北美廣泛使用，適于

試驗(yàn)站 工廠化栽培，或罐藏或鮮銷

美國(guó) Sylvan公司 S130 HG4 適于工廠化栽培，鮮銷

S608 HG4 適于工廠化栽培，鮮銷

S512 HG4 適于工廠化栽培，罐藏與鮮銷

法國(guó) F56 HG4 在歐洲廣泛使用，罐藏與鮮銷

F50 HG4 在歐洲廣泛使用，罐藏與鮮銷