參考:王關(guān)林,方宏筠主編,植物基因工程[M].第2版,北京:科學(xué)出版社,2002,742-744.
1) 取1克菌絲放入研缽,加入液氮迅速研磨成粉末,轉(zhuǎn)入7 mL的離心管,加2.5mL 65℃預(yù)熱的抽提液(2 %(m/v)CTAB,100m mol/L Tris-HCl PH8.0,20mmol/L EDTA PH8.0,1.4mol/L NaCl),加巰基乙醇50μl,震蕩,使蛋白質(zhì)變性沉淀;
2) 65℃水浴1 h,每隔10 min振蕩1次,加入2.5 mL的氯仿/異戊醇(24/1)混勻,除去蛋白質(zhì);
3) 8000 rpm,4℃離心10 min,取上清;
4) 加1/5體積65 ℃預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻,加入2.5 mL的氯仿:異戊醇(24:1)混勻;
5) 10000 rpm, 4℃離心10 min,取上清,加入2.5 ml的CTAB沉淀液,顛倒,混勻。65℃水浴1.5h至沉淀可見;
6) 12000 rpm,4℃離心10 min后,去除上清液,用0.5ml無(wú)菌水溶解沉淀10 min;
7) 加入0.25 mL飽和酚和0.25 mL氯仿:異戊醇(24:1),混勻;
8) 12000 rpm,4℃離心10 min,取上清,加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,混勻,-20 ℃冰箱放置30 min;
9) 12000 rpm,4℃離心10 min;棄上清,加70%乙醇洗滌沉淀2次,自然風(fēng)干,再加100μlTE溶解,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>