復(fù)方靈芝降糖膠囊對(duì)胰島B細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào) 2000年第1期第17卷 實(shí)驗(yàn)研究

作者：陳文良　黃萍　吳清和　徐鴻華　榮向路　韓堅(jiān)

單位：廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州　510405

關(guān)鍵詞：@復(fù)方靈芝降糖膠囊/藥理學(xué)；靈芝/藥理學(xué)；黃芪/藥理學(xué)；糖尿病/中藥療法；胰島/藥物作用；疾病模型，動(dòng)物

　　摘要：為探討廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心研制的復(fù)方靈芝降糖膠囊(靈芝、黃芪、三七等中藥組成)治療糖尿病的作用機(jī)理，觀察該藥對(duì)鏈脲霉素所致糖尿病模型大鼠的胰島B細(xì)胞形態(tài)等方面的影響。結(jié)果表明，復(fù)方靈芝降糖膠囊可提高實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠胰島B細(xì)胞體密度(P＜0.001)，對(duì)受損的胰島B細(xì)胞具有修復(fù)和再生的作用，這可能是復(fù)方靈芝降糖膠囊治療糖尿病的機(jī)理之一。

　　中圖分類號(hào)：R285.5　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

　　文章編號(hào)：1007-3213(2000)01-0051-04

Effect of Compound Lingzhi Jiangtang Capsule on Morphology of Islet B Cell in Rats

CHEN Wenliang

　　(Shenzhen Pharmaceutical Factory of Chinese Materia Medica,Shenzhen 518029,China)

　　HUANG Ping,WU Qinghe,XU Honghua,RONG Xianglu,HAN Jian

　　(Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)

　　Abstract:To explore the mechanism of Compound Lingzhi Jiangtang Capsule for diabetes mellitus,the effect of Compound Lingzhi Jiangtang Capsule on morphology of islet B cell in rats with diabetes mellitus was studied.Results showed that Compound Lingzhi Jiangtang Capsule could increase the volume density of islet B cell(P＜0.001) and promote the repair and regeneration of the damaged islet B cell.

　　Key words:@ COMPOUND LINGZHI JIANGTANG CAPSULE/pharmacology;LINGZHI/pharmacology;ASTRAGALUS MEMBRANACEUS/pharmacology;DIABETES MELLITUS/TCD therapy;ISLETS OF LANGERHANS/drug eff.;DISEASE MODELS,ANIMAL

　　由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心研制的復(fù)方靈芝降糖膠囊主要由靈芝、黃芪、三七等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾益腎、活血化瘀的功效，主治糖尿病及其合并癥。本研究從藥物對(duì)胰島B細(xì)胞形態(tài)的影響等方面，探討了復(fù)方靈芝降糖膠囊治療糖尿病的作用機(jī)理。

　　1　實(shí)驗(yàn)材料

　　1.1　藥物　復(fù)方靈芝降糖膠囊，每粒含生藥4.46g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心提供，批號(hào)980428。使用時(shí)以蒸餾水配制成所需濃度。優(yōu)降糖：天津市力生制藥廠產(chǎn)品，批號(hào)9703004。

　　1.2　動(dòng)物　SD系大鼠(合格證號(hào)：97A018)，由廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)用動(dòng)物場(chǎng)提供。

　　1.3　試劑與儀器　鏈脲霉素：進(jìn)口分裝，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)980420。小鼠抗人和動(dòng)物胰島素血清：進(jìn)口分裝，武漢博士德生物公司產(chǎn)品，批號(hào)SA1021。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)DS7028。

　　2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

　　選取健康大鼠32只，雌雄各半。參照文獻(xiàn)［1］方法，用鏈脲霉素給大鼠尾靜脈注射誘導(dǎo)出糖尿病模型，以血糖值c≥10mmol/L的大鼠作為糖尿病模型，隨機(jī)分為模型組、優(yōu)降糖組、復(fù)方靈芝降糖膠囊低、高劑量組，每組動(dòng)物各8只，另取未經(jīng)造模的同批大鼠8只作為正常對(duì)照組。每天灌胃給藥1次(對(duì)照組和模型組給蒸餾水)，第20天灌胃給藥后1h將動(dòng)物脫頸椎處死，迅速剖腹取其胰尾組織，Bouin液固定，石蠟包埋，制成6μm和4μm厚的連續(xù)切片，分別作HE及胰島B細(xì)胞免疫化學(xué)染色。

　　2.1　HE染色　HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組切片胰島數(shù)目較多，輪廓規(guī)則整齊，胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊，胞漿飽滿，細(xì)胞界限清楚。模型組切片胰島數(shù)目較少，胰島內(nèi)形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞排列紊亂，常有細(xì)胞缺失、塌陷。在400倍鏡下還可更清楚地看到以下形態(tài)：正常組切片胰島內(nèi)充滿藍(lán)色的B細(xì)胞分泌顆粒，細(xì)胞排列緊湊、整齊，分布均勻。模型組切片胰島內(nèi)B細(xì)胞有嚴(yán)重的脫顆粒現(xiàn)象，少數(shù)細(xì)胞塌陷、缺失，排列不規(guī)則。陽(yáng)性組和復(fù)方靈芝降糖膠囊用藥各組均有不同程度的改觀(見圖1)。

1　胰島B細(xì)胞HE染色電鏡切片圖

　　A.正常組；B.模型組；C.復(fù)方靈芝降糖膠囊高劑量組；D.復(fù)方靈芝降糖膠囊低劑量組

　　2.2　胰島B細(xì)胞免疫化學(xué)染色　胰島B細(xì)胞免疫化學(xué)染色片鏡下陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色，正常胰腺為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以PBS緩沖液代替一抗。然后取各組胰島B細(xì)胞免疫化學(xué)染色切片，每片隨機(jī)取3個(gè)胰島視野參考Weibel方格系統(tǒng)計(jì)數(shù)法［2］，應(yīng)用雙方形網(wǎng)格測(cè)試板直接在顯微鏡下計(jì)數(shù)，求出B細(xì)胞體密度。

　　B細(xì)胞體密度p=PB/PI×100(PI為落在胰島內(nèi)點(diǎn)數(shù)，PB為落在B細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)數(shù))。

　　2.2.1　免疫組化染色

　　結(jié)果見圖2。

2　胰島B細(xì)胞免疫組化染色電鏡切片圖

　　A.正常組；B.模型組；C.復(fù)方靈芝降糖膠囊高劑量組；D.復(fù)方靈芝降糖膠囊低劑量組

　　正常組：胰島一般為圓形或長(zhǎng)橢圓形，體積大小不一，個(gè)別胰島形態(tài)不規(guī)則，有呈半月形、彎曲的圓子柱狀等形態(tài)。B細(xì)胞(免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞)主要分布于胰島中心部位，排列較規(guī)則，一般呈圓形，大小均勻，胞質(zhì)較多，胞漿中充滿粗大的胰島素染色顆粒，均勻地散布于整個(gè)胰島，胞核不著色，但可清楚地觀察到其輪廓，多呈圓形或橢圓形。

　　模型組：染色片中胰島素染色顆粒較少，B細(xì)胞松散排列，分布不規(guī)則，有的胞漿中胰島素染色顆粒明顯減少使細(xì)胞呈空虛狀態(tài)。

　　優(yōu)降糖和復(fù)方靈芝降糖膠囊高劑量組：染色片中胰島B細(xì)胞在胰島內(nèi)的分布、細(xì)胞形態(tài)、染色顆粒的分布等方面與模型組比較均有不同程度的改觀，胰島B細(xì)胞染色顆粒較多，胞質(zhì)飽滿。

　　復(fù)方靈芝降糖膠囊低劑量組：染色片中胰島B細(xì)胞在胰島內(nèi)的分布、細(xì)胞形態(tài)、染色顆粒的分布等方面與模型組比較未發(fā)現(xiàn)明顯的變化。

　　2.2.2　定量分析

　　結(jié)果見表1。

　表1　復(fù)方靈芝降糖膠囊對(duì)糖尿病模型大鼠胰島

　　B細(xì)胞體密度(p)的影響()

組　別 N/只 w/(g?kg-1) p/%

對(duì)照組 8 - 68.84±17.49

模型組 8 - 21.13±7.60△△△

優(yōu)降糖組 8 0.005 43.00±15.54**

靈芝降糖低劑組 8 1.84 25.58±10.30

靈芝降糖高劑組 8 7.40 56.40±9.16***

　　△△△與對(duì)照組比較P＜0.001；**與模型組比較P＜0.01，***P＜0.001

　　表1顯示，復(fù)方靈芝降糖膠囊高劑量組可提高大鼠B細(xì)胞體密度(與模型組比較P＜0.001)；低劑量對(duì)大鼠B細(xì)胞體密度的改善無明顯作用(P＞0.05)，優(yōu)降糖亦可提高大鼠B細(xì)胞體密度(與模型組比較P＜0.01)。

　　3　討論

　　糖尿病是一種急性或慢性的代謝障礙性疾病，主要是由于胰島素的絕對(duì)或相對(duì)缺乏所引起。已有大量事實(shí)證明，無論是Ⅰ型糖尿病還是Ⅱ型糖尿病，其發(fā)病均與胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞功能異常有關(guān)。胰內(nèi)分泌腺含有幾十萬(wàn)個(gè)內(nèi)分泌腺體―angerhans氏島(即胰島)，它分散地分布在胰外分泌腺體中。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，胰島中至少有4種細(xì)胞，即A、B、D及F細(xì)胞，而且這些細(xì)胞的分布、功能又有很大差別。目前所知，與糖尿病關(guān)系比較密切的主要是在胰尾部分布較多的A細(xì)胞(約占20%)和B細(xì)胞(約占75%)，前者分泌的胰高血糖素和后者分泌的胰島素(RI)、C肽等對(duì)體內(nèi)的血糖調(diào)節(jié)起著重要的作用。糖尿病的發(fā)生與胰島組織細(xì)胞功能障礙，尤其是B細(xì)胞的功能不足有很大關(guān)系。隨著細(xì)胞組織免疫化學(xué)染色技術(shù)的飛速發(fā)展，在糖尿病機(jī)制的研究中有關(guān)B細(xì)胞形態(tài)學(xué)的探討越來越受到人們重視。有學(xué)者在電鏡下觀察到，胰腺B細(xì)胞中β顆粒是通過“細(xì)胞嘔吐”(Cell Vomiting)的方式排出的，圍繞顆粒的膜先與細(xì)胞膜融合，然后融合部位裂開，顆粒就從細(xì)胞排出，離開細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞外間隙，再經(jīng)過毛細(xì)血管內(nèi)皮進(jìn)入血液循環(huán)。B細(xì)胞內(nèi)β顆粒的數(shù)量與胰腺的胰島素含量平行，當(dāng)胰島素分泌后，可看到B細(xì)胞脫顆粒現(xiàn)象(顆粒減少)［3］。這樣就從微觀層面上證實(shí)了胰島結(jié)構(gòu)與功能的緊密相關(guān)性。

　　鏈脲霉素(STZ)對(duì)動(dòng)物胰島B細(xì)胞有特異性的殺傷作用，已被廣泛用于制備實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型。在本實(shí)驗(yàn)中所采用的胰島兩種染色方法結(jié)果顯示，模型組切片與正常組切片比較在形態(tài)學(xué)上有很大差異，模型組大鼠的染色片中胰島周圍組織結(jié)構(gòu)紊亂，胰島數(shù)目少，B細(xì)胞松散排列，分布不規(guī)則，有的胞漿中胰島素染色顆粒明顯減少使細(xì)胞呈空虛狀態(tài)。陽(yáng)性組和復(fù)方靈芝降糖膠囊組的染色片中胰島及胰島B細(xì)胞的形態(tài)均有不同程度的改觀。

　　在采用免疫組化方法對(duì)其進(jìn)行B細(xì)胞體密度的計(jì)量研究中發(fā)現(xiàn)，模型組B細(xì)胞體密度與正常比較明顯減少，復(fù)方靈芝降糖膠囊對(duì)大鼠的B細(xì)胞體密度有明顯改善作用。

　　本研究證明復(fù)方靈芝降糖膠囊對(duì)STZ造成的大鼠胰島B細(xì)胞的損傷有一定的治療作用，對(duì)保持胰島B細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、維持正常的生理功能有著重要的作用，從而保證了B細(xì)胞合成、釋放胰島素各環(huán)節(jié)功能正常，在一定意義上防止了糖尿病的發(fā)生。研究結(jié)果提示，促進(jìn)受損胰島B細(xì)胞的修復(fù)和再生是復(fù)方靈芝降糖膠囊治療糖尿病的機(jī)理之一。

　　基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(1997-1)

　　作者簡(jiǎn)介：陳文良，男，1973年出生，碩士；

　　參考文獻(xiàn)：

　　［1］大西r之，山田俊雄，山田和雄，他.ストレプトゾトシンおょびサイプロヘプタジンによゐ實(shí)驗(yàn)的糖尿病モデルの比較［J］.日本藥理學(xué)雜志，1986(87)：105

　?。?］Weibl E R.Sterological Methods.In:Practical methods for biological morphology［M］.London：Academic Press,1979.91

　?。?］楊鋼.內(nèi)分泌生理與病理生理學(xué)［M］.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1996