靈芝多糖的藥效學(xué)研究

Ⅰ．抗惡性腫瘤、抗血栓和抗凝血作用

陳建濟 吳志強 王秀敏 李克華 劉廣芬 王晴川 (福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所 350004)胡 恩 林志偉 楊 亮 王素香 林珉弘 (福建中醫(yī)學(xué)院中藥系實習(xí)生 350003)

摘要　本文用1．靈芝子實體經(jīng)水提、乙醇沉制得靈芝多糖（GLPS）精品，用苯酚-硫酸法測其百分含量。2．應(yīng)用小鼠移植性惡性腫瘤瘤株（S\-\{180\}、U\-\{14\}、EAC)，觀察GLPS對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響。3．觀察GLPS對小鼠全血凝血時間及出血時間和大鼠血栓及血液凝固系統(tǒng)的影響。實驗結(jié)果1．用本方法提取GLPS得率為0．589±0．135％。2．GLPS 40 mg／(kg*d)．ig×17 d對小鼠肉瘤（S-180）和宮頸癌（U-14）的平均抑瘤率分別為43％和51％，而對艾氏腹水癌（EAC）小鼠生命沒有明顯延長作用（P＞0．05）。3．GLPS 20 mg／(kg*d)．ig×10 d或20～40 mg*kg-1．iv均能明顯延長小鼠的凝血時間和出血時間（P＜0．01)。GLPS 40 mg／(kg*d)．ig×10 d能明顯抑制大鼠的血栓形成（P＜0．01)，降低纖維蛋白原的含量（P＜0．01），同時能明顯延長部分凝血活酶時間（KPTT）（P＜0．01）。說明GLPS具有抗腫瘤、抗血栓和抗凝血的作用。

關(guān)鍵詞　靈芝多糖，抗腫瘤，抗血栓，抗凝血Studies on the Pharmacological Effects of the Polysaccharides of Ganoderma LucidumⅠ．Anticancer，Antithrombosis and anticoagulation of bloodChen Jianji，Wu Zhiqiang，et al （Fujian Medical University，Laboratory of Snake Venom Research　350004）Hu En,Lin Zhiwei et al (Fujian Colloege of Traditional Chinese Medicine 350003)Abstract Study on the anticancer activity and the effect on blood coagulation of Polysaccharides separated Ganoderma lucidum(ling zhi)was reported in this paper．Polysaccharide of Ganoderma lucidum（GLPS）was separated by water extraction and ethanol precipitation．The yield of GLPS separated from native drug was about 0．589±0．139％ by phenol-sulfuric acid method．a(chǎn)ssayed. The cancer cell line of S-180 and U-14 were implanted into the axillary subcutaneous of mice for studying the anticancer effect．It indicated that Glps GLPS 40 mg*kg-1．ig．d×17 d decreased the weight of cancer by about 43％（S-180） and 51％（U-14）．The clotting and bleeding time of mice blood were uses for observing the effect on coagulation．The antithrombotic effect was assayed on rats by thrombosis test ex vivo．GLPS 20 mg*kg-1．d ig×10 d and 20～40 mg*kg-1．iv into mice prolonged the blood clotting and bleeding time（P＜0．01）．a(chǎn)nd GLPS 40 mg*kg-1．d．ig×10 d into rats decreased thrombosis and fibrinogen level of blood plasma（P＜0．01），the kaolin partial thrombin time was prolonged（P＜0．01）．These can conclusion that the GLPS of Ganoderma lucidum possessed the anticancer，antithrombosis and anticoagulation effects．Key words Polysaccharide of Ganoderma lucidum，Anticancer，Antithrombosis，Anticoagulation

靈芝［赤芝，Ganoderma Lucidum（Leyys．ex Fr）Karst］為一種靈芝屬的真菌。中國歷代醫(yī)家視為滋補強壯，扶正固本，延年益壽之珍品 。靈芝多糖是靈芝的主要有效成分之一，具有多種的生理活性。本文主要對靈芝多糖抗腫瘤、抗血栓和抗凝血方面的作用進行研究。1 材 料1．1 藥品與試劑　靈芝子實體購自三明真菌研究所；5-氟尿嘧啶注射液（5-FU）為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號971006；環(huán)磷酰胺（CPM）為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品，批號960102；凍干凝血酶、凝血活酶及部分凝血活酶均為上海醫(yī)大華山醫(yī)院技協(xié)試劑公司的產(chǎn)品，批號99035；纖維蛋白測定酸性緩沖液為寧波市慈城生化試劑廠生產(chǎn)，批號980819；5-腺苷二磷酸二鈉鹽（ADP）為上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1．2 動物　昆明種小鼠體重為18～22 g，Wistar種大鼠體重為300±20 g ，雌雄兼用，均由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。1．3 瘤株　小鼠肉瘤（S\-\{180\}）、宮頸癌（U\-\{14\}）及艾氏腹水癌（EAC）均自上海中國科學(xué)院藥物研究所引進，在福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒所傳代使用。1．4 儀器　多功能雙通道血液凝聚儀，電腦血漿纖維蛋白原測定儀，MR-4型多環(huán)血栓檢測儀均為上海高機應(yīng)用技術(shù)研究所產(chǎn)品；80-2型離心機為上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)；7520型分光光度計為上海分析儀器廠生產(chǎn)；TG729C單盤電光分析天平為上海天平儀器廠生產(chǎn)。2 方法和結(jié)果2．1 靈芝多糖的提取及含量測定2．1．1 提取流程［1］

2．1．2 含量測定(2,3)　以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度（10～80 μg*ml-1）的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取1 ml標(biāo)準(zhǔn)液置于10 ml具塞比色管中，加入1 ml 5％苯酚和5 ml濃硫酸，搖勻反應(yīng)20 min，于487 nm處測其吸收值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，制取標(biāo)準(zhǔn)曲線并求其回歸方程，結(jié)果見表1。表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

管號 0 1 2 3 4 5 6

葡萄糖濃度（μg*ml-1） 0 10 20 40 50 60 80

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml） 0 1 1 1 1 1 1

5％苯酚（ml） 1 1 1 1 1 1 1

濃硫酸（ml） 5 5 5 5 5 5 5

A\-\{487 nm\} 0 0．175 0．262 0．427 0．519 0．648 0．795

稱取各批靈芝多糖粗品10 mg，配成0．1 mg*ml-1的水溶液作為供試液，各取1 ml依上法測其吸收值（5批GLPS粗品的A\-\{487 nm\}分別為0．697，0．682，0．670，0．656，0．671），代入回歸方程，求出靈芝多糖的含量及提取率，結(jié)果(見表2)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝0．085＋0．0090x（r＝0．9978）表2 靈芝多糖粗品中靈芝多糖的含量及提取率

批號 1 2 3 4 5

靈芝子實體干重（g） 335 376 416 255 274

靈芝多糖粗品（g） 3．00 3．11 3．20 3．12 3．42

靈芝多糖含量（％） 68．0 66．3 65．0 63．4 65．1

靈芝多糖提取率（％） 0．609 0．548 0．500 0．476 0．813

2．2 靈芝多糖的抗腫瘤作用(4,5)2．2．1 靈芝多糖對實體型移植瘤小鼠瘤塊生長的影響　每次實驗用同一性別小鼠，隨機分為3組：生理鹽水（NS)組、靈芝多糖(GLPS))組和5-氟尿嘧啶（5-FU）組或環(huán)磷酰胺（CPM）組。GLPS組提前灌胃（ig）40 mg／(kg．d)1周后，給各組小鼠接種瘤塊。在無菌條件下，從荷瘤10～14 d、S180或U14瘤塊生長良好的小鼠采取并切成直徑2 mm～3 mm的瘤塊，用套管針將其種入小鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后GLPS組繼續(xù)給藥10 d，5-FU組腹腔注射（ip）5-FU 20 mg*kg-1 4次或CPM組ip CPM 50 mg*kg-1 2次，隔日一次，NS組ig同一體積的生理鹽水。于停藥后處死小鼠，剝下皮下瘤塊并稱重，按下式計算抑瘤率。靈芝多糖對小鼠S180和U14的平均抑瘤率分別為43％和51％，靈芝多糖組的平均瘤重明顯輕于NS組（P＜0．01)，結(jié)果(見表3及圖1和表4及圖2)。抑瘤率＝（1－(給藥組動物平均瘤重)/(NS組動物平均瘤重)）×100％表3 靈芝多糖灌胃對小鼠肉瘤（S180）生長的影響（n＝10，X-±S）

　 藥物 劑量（mg／kg．d×d） 瘤重（g） 抑瘤率（％） P值

第一次 NS － 1．4±0．4 － －

　 GLPS 40×17 0．8±0．2 40 ＜0．01

　 5-FU 20×4 0．9±0．4 21 ＞0．05

第二次 NS － 2．4±0．9 － －

　 GLPS 40×17 1．2±0．7 47 ＜0．01

　 5-FU 20×4 1．8±0．6 24 ＞0．05

第三次 NS － 2．8±0．8 － －

　 GLPS 40×17 1．6±0．4 42 ＜0．01

　 CPM 50×2 0．2±0．2 93 ＜0．001

2．2．2 靈芝多糖對腹水型移植瘤的小鼠存活時間的影響　每次實驗用同一性別 小鼠，隨機分為3組：（NS）組、靈芝多糖(GLPS)組和環(huán)磷酰胺(CPM)表4 靈芝多糖灌胃對小鼠宮頸癌（U14）生長的影響（n＝10，X-±S）

　 藥物 劑量（mg／kg．d×d） 瘤重（g） 抑瘤率（％） P值

第一次 NS － 3．8±1．1 － －

　 GLPS 40×17 1．9±0．7 49 ＜0．01

　 5-FU 20×4 2．4±1．8 36 ＜0．01

第二次 NS － 3．8±1．0 － －

　 GLPS 40×17 2．4±0．9 40 ＜0．01

　 CPM 50×2 0．1±0．6 97 ＜0．001

第三次 NS － 4．0±0．9 － －

　 GLPS 40×17 2．3±0．9 44 ＜0．01

　 CPM 50×2 0．5±0．5 88 ＜0．001

第四次 NS - 3.6±1．0 － －

　 GLPSⅠ 40×17 1．8±0．5 50 ＜0．01

　 GLPSⅡ 80×17 1．7±0．4 52 ＜0．01

　 CPM 50×2 1．2±0．4 67 ＜0．01

圖1 靈芝多糖灌胃對小鼠肉瘤（S180）生長的影響

圖2 靈芝多糖灌胃對小鼠宮頸瘤（U14）生長的影響組。GLPS組提前灌胃（ig）40 mg／(kg．d)1周后。在無菌條件下，取接種7～8 d生長良好的艾氏腹水癌（EAC）制成1∶4腫瘤細(xì)胞生理鹽水混懸液，給每只小鼠接種0．2 ml。接種后GLPS組繼續(xù)給藥10 d，CPM組ip CPM 50 mg*kg-1 2次，隔日1次，NS組ig同一體積的生理鹽水。于停藥后觀察每只小鼠的生存天數(shù)，按下式計算生命延長率。實驗重復(fù)3次，與NS組比較40 mg*kg-1的GLPS沒有明顯延長小鼠的生命（P＞0．05），平均生命延長率為15％，結(jié)果(見表5)。生命延長率＝(給藥動物平均存活天數(shù)／對照動物平均存活天數(shù)－1)×100％表5 靈芝多糖灌胃對艾氏腹水癌（EAC）小鼠存活時間的影響（n＝10）

　 藥物 劑量（mg／kg．d×d） 　 小鼠生存天數(shù)X-±S 生命延長率（％） P值

第一次 NS － 12．5±1．3 － －

　 GLP 40×17 13．9±0．7 11 ＞0．05

　 CPM 50×2 15．9±1．8 28 ＜0．01

第二次 NS － 11．8±1．5 － －

　 GLP 40×17 13．8±1．0 17 ＞0．05

　 CPM 50×2 15．1±2．9 27 ＜0．01

第三次 NS － 11．8±1．6 － －

　 GLP 40×17 13．9±1．7 18 ＞0．05

　 CPM 50×2 16．0±1．7 36 ＜0．01

2．3 靈芝多糖對小鼠全血凝血時間及出血時間的影響2．3．1 靈芝多糖對小鼠全血出血時間的影響(6)　取小鼠50只，隨機分為4組，GLPS組和一組NS組。GLPS組Ⅰ GLPS 20 mg／(kg．d)．ig×10 d。NS組ig同體積的生理鹽水。GLPS組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別GLPS 40、30、20 mg*kg-1．iv后1 h，用利剪將小鼠距尾尖3 mm處剪斷，待血自行溢出時開始計量，每隔30 S用濾紙吸去血滴一次，直至血流停止(以濾紙吸至無血跡時為準(zhǔn))計算出血時間，所得數(shù)據(jù)與NS組進行顯著性檢驗。結(jié)果表明：靈芝多糖能明顯延長小鼠的出血時間（P＜0．01），(見表6)。表6 靈芝多糖對小鼠凝血和出血時間的影響（n＝10，X-±S）

組別 藥物劑量及途徑（mg／kg．d） 出血時間(s） 凝血時間（s）

NS組 － 185±74 75±22

GLPS組Ⅰ 40×10．ig 872±46** 172±43**

GLPS組Ⅱ 40．iv 780±50** 116±27**

GLPS組Ⅲ 30．iv 720±40** 115±15**

GLPS組Ⅳ 20．iv 720±40** 108±14**

與NS組比較，**：P＜0．012．3．2 靈芝多糖對小鼠全血凝血時間的影響(7)　取測定出血時間的各組小鼠，用彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球，于載玻片兩端各滴1滴直徑5 mm的血滴。立即用秒表記時，每隔一定時間用清潔針頭自血滴邊緣向里輕輕挑動1次，觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲為止，所歷時間即為凝血時間。另取1滴血作為正常凝血情況判別對照。記錄各小鼠的凝血時間，進行顯著性檢驗。結(jié)果表明：靈芝多糖能顯著延長小鼠的凝血時間（P＜0．01），(見表6)。2．4 靈芝多糖對大鼠血栓形成及血液凝固系統(tǒng)的影響。取大鼠20只，隨機分成NS組、GLPS組。GLPS組ig GLPS 40 mg／(kg．d)×10 d，NS組ig同體積的生理鹽水。給藥10 d后，用20％烏拉坦按\{0．5 ml*100 g-1體重ip麻醉后，打開大鼠胸腔，暴露心臟采血3 ml，其中0．5 ml直接用MR-4型多環(huán)血栓測定儀測定血栓長度和濕重（Chandler氏法)。另2．5 ml血加入0．3 ml（按9∶1）枸櫞酸鈉（3．8％）混勻，100 RPM離心5 min，吸取0．1 ml富血小板血漿（PRP)于特制的小試管中，用多功能雙通道血液凝聚儀測定血小板數(shù)目。再以3000 RPM離心10 min，吸取0．1 ml貧血小板血漿（PPP），加入相應(yīng)的酶試劑后，用多功能雙通道血液凝聚儀分別檢測凝血活酶時間（PT)、凝血酶時間(TT)、部分凝血活酶時間(KPTT)。另在小試管中加入2 ml纖維蛋白原酸性緩沖液和0．1 ml PPP，混勻，置入電腦血漿纖維蛋白原測定儀測定纖維蛋白原含量。結(jié)果表明：靈芝多糖能明顯減少大鼠血栓的長度和濕度（P＜0．01），并降低纖維蛋白原含量（P＜0．01），明顯延長KPTT時間（P＜0．01）(見圖3)。

圖3 靈芝多糖（40 mg／kg．d．ig×10 d）對大鼠血液凝固系統(tǒng)的影響 3 討論 靈芝多糖是靈芝的主要有效成分之一，我們用水提、醇沉法提取靈芝多糖，并經(jīng)透析除去分子量1萬以下的成分，得到靈芝多糖粗品。以上實驗結(jié)果說明：靈芝多糖具有抗腫瘤、抗血栓及抗凝血的作用。本所實驗證明GLPS對試管培養(yǎng)的癌細(xì)胞無直接殺傷作用，故靈芝多糖抗腫瘤作用可能是通過增強機體免疫功能而實現(xiàn)的［8～10］。靈芝多糖能降低纖維蛋白原含量，減弱部分凝血活酶的活性使其影響內(nèi)源性凝血途徑，并能抗血栓和抗凝血，其機理尚待探討。參考文獻(xiàn)［1］何云慶等，靈芝扶正固本有效成分靈芝多糖的化學(xué)研究 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 1989；21（3）：225～227［2］Dubois M，et al：colarmetric method for defermination of sugars and related substances，Anal Chem，1956，28：350～352［3］方積年：多糖的分離純化及其純度鑒別與分子量測定 藥學(xué)通報 1984；19（1）：622～625［4］潘啟超等：腫瘤藥理學(xué)及化學(xué)治療學(xué)，廣州，廣東高等教育出版社，1989；［5］李連達(dá)：抗癌中藥的藥效學(xué)研究技術(shù)要求 中藥新藥與臨床藥理 1992；392）：6［6］徐叔云等主編：藥理學(xué)實驗方法學(xué)，第二版，北京，人民衛(wèi)生出版社，1991；1991；481［7］陳奇主編：中藥藥理研究方法學(xué)，第一版，北京，人民衛(wèi)生出版社，1991；481［8］雷林生等：靈芝多糖對抗環(huán)孢霉A、氫化可的松及抗腫瘤藥的免疫抑制作用 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志 1993；7：183［9］雷林生等：靈芝多糖對老年小鼠脾細(xì)胞DNA多聚酶a活性及免疫功能的影響 藥學(xué)學(xué)報 1993；28（2）：577～582［10］曹容華等：靈芝多糖抗腫瘤作用的機理研究 山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 1992；30（3）：203～206