用-150~-196℃的液氮超低溫保藏菌種，是現(xiàn)在菌種保藏中使用的一項先進技術(shù)。目前， 美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏委員會(American Type Cultur Collection，ATCC) 保存的17萬余株微生物菌種， 全部采用冷凍干燥和液氮超低溫法保藏。超低溫能使菌種的代謝水平降到最低，菌種基本上不發(fā)生變異。試驗證明，用這種方法能保存所有的食用菌菌種，包括一些不能用冷凍干燥法保藏的菌種。美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏委員會曾用液氮法保藏了粗柄羊肚菌、大禿馬勃、墨汁鬼傘等培養(yǎng) 真菌，連續(xù)觀察了9年，發(fā)現(xiàn)這些菌種仍能保持良好的活力。也有人將蘑菇菌種在-160~-196℃下保藏22~26個月后，發(fā)現(xiàn)這些菌種仍完好無損。最有趣的V定 是怕冷的草菇在10%甘油保護下，居然也能在超低溫冰箱中保藏。
       雖然液氮保藏法有保藏的菌種不宜郵寄交流，還需要特殊的設(shè)備———液氮罐等缺點，但其保藏效果好、范圍廣、操作簡單，因此得到普遍應(yīng)用，其方法如下：
       (1)將保藏用的瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯煮汁1000mL、葡萄糖20g、酵母膏1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂0.5g、瓊脂20g)倒人無菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平或少 板，然后在平板中心接種食用菌菌絲，在適溫下培養(yǎng)至菌絲發(fā)滿平板。
       (2) 保藏安部瓶的口徑約10mm， 大小為7.5mmx10mm， 內(nèi)盛經(jīng)滅菌的冰滿 凍保護劑0.8mL。冰凍保護劑常用10%甘油或10%二甲亞砜(DMSO) ， 需經(jīng)高壓滅菌后使用。
       (3)取直徑5mm的打孔器在菌落的外圍切割瓊脂塊，用無菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入滅菌的保藏安瓿瓶內(nèi)的保護劑中。注意在保藏菌種管上作永久標(biāo)記。也可直接用無菌保護劑制備菌懸液。
       (4)用火熔封安部瓶的瓶口。
       (5)將封好口的安部瓶放在慢速冷凍器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降藏 溫，直至-35℃左右，使瓶內(nèi)的保護劑和菌絲塊凍結(jié)。然后凍結(jié)速度不再控制，至到-150℃以下。將凍結(jié)的安部瓶立即置于液氮罐中保藏。液氮罐內(nèi)氣相溫度為-150℃，液相溫度為-196℃。
       (6)復(fù)蘇培養(yǎng)。啟用液氮超低溫保存的菌種時，應(yīng)先將安瓿瓶置于35~40℃的溫水中來回振蕩，使瓶內(nèi)的冰塊迅速融化，然后在無菌條件下開啟安瓿瓶，取懸浮的菌絲塊移植于適宜的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。
使用液氮超低溫法保藏菌種時，操作者要戴皮手套或棉手套，嚴(yán)防液氮飛濺傷人；取菌種時，要垂直輕取蓋塞，再垂直提起提筒，輕輕移到容器中取物。取畢立即將提筒與蓋塞復(fù)位，以防空氣中氮氣過濃引起窒息。