母種培養(yǎng)基的配制
1. 母種培養(yǎng)基的種類
母種是菌種生產(chǎn)的關(guān)鍵，要求純度高，不能混生雜菌，同時(shí)母種的菌絲體較為纖細(xì)，分解培養(yǎng)料的能力較弱。因此，母種菌絲體需要培養(yǎng)在營養(yǎng)豐富，易被吸收，表面光滑易于鑒別有無雜菌感染的瓊脂培養(yǎng)基上。適合母種菌絲生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基種類很多，常用的有下列幾種：
① 馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 馬鈴薯（去皮） 200克 瓊脂 20克 葡萄糖（或蔗糖） 20克 水 1000毫升
?、?麥芽汁—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 干麥芽 250克 瓊脂 15～20克 葡萄糖（或蔗糖） 10克 水 1000毫升
?、?胡蘿卜—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 胡蘿卜 100克 瓊脂 20克 葡萄糖（或蔗糖） 20克 水 1000毫升
?、?蘑菇汁—葡萄糖一瓊脂培養(yǎng)基（適用于蘑菇）： 鮮蘑菇 250克 瓊脂 20克 葡萄糖（或蔗糖） 20克 水 1000毫升
?、?蛋白胨—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 蛋白胨 2克 葡萄糖 20克 磷酸氫二鉀 2克 維生素B1（硫胺素） 0.5毫克 磷酸二氫鉀 0.5克 瓊脂 18克 硫酸鎂 0.5克 水 l000毫升
2. 母種培養(yǎng)基的制法
以最常用的馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基的制法為例介紹如下：先將馬鈴薯去皮，洗滌，切成小塊加水1000毫升，煮沸15～20分鐘，取雙層紗布過濾，取其濾液，加入瓊脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加熱使其溶化，最后補(bǔ)足水分，使其容量仍為1000毫升。趁熱分裝于試管中，裝量約為試管長(zhǎng)度的1/5左右，裝管時(shí)要注意不使培養(yǎng)基沾污試管壁和試管口。試管口塞上大小合適的棉花塞，塞入試管口內(nèi)的長(zhǎng)度為棉塞總長(zhǎng)的3/5。塞好棉塞后，每10支作一捆，用牛皮紙包扎好后，置鐵絲網(wǎng)籠中，然后進(jìn)行高壓滅菌。如作為孢子分離用，則將培養(yǎng)基分裝于三角瓶或培養(yǎng)皿中，然后高壓滅菌。
3. 母種培養(yǎng)基的消毒滅菌
母種培養(yǎng)基通常用高壓蒸汽滅菌鍋來消毒滅菌，常用的高壓蒸汽滅菌鍋有直式、臥式和手提式三種。將配制好后的母種培養(yǎng)基移入上述任何一種高壓蒸汽滅菌鍋中，在15公斤/平方厘米 壓力下，消毒滅菌30分鐘。
高壓蒸汽滅菌主要是依靠提高蒸汽的溫度來滅菌的，因此滅菌時(shí)，應(yīng)將鍋內(nèi)的冷空氣全部排除。否則，盡管壓力表上的壓力已達(dá)到要求，然而，滅菌鍋內(nèi)的溫度卻未達(dá)到所需的溫度（表11）。排除冷空氣的方法是加熱后當(dāng)壓力表上指針上升到0.5公斤/平方厘米時(shí)，打開排氣閥，放氣至指針仍回到“零”的位置。滅菌的時(shí)間是以排除冷空氣后，壓力回升到1.5公斤/平方厘米 時(shí)才開始計(jì)算。每次滅菌之后，要等壓力降到“零”時(shí)，才打開鍋蓋，否則，滅菌的液體會(huì)因突然減壓而外溢，玻璃器皿也會(huì)因突然降溫而破裂。
下表高壓滅菌時(shí)壓力的換算及其與溫度的關(guān)系 ：
磅/平方英寸 公斤/平方厘米 滅菌器中的溫度（℃）
排除空氣 未排除空氣
5 0.352 108.4 72
10 0.703 115.2 90
15 1.055 121.0 100
20 1.406 126.0 109
25 1.758 130.4 115
30 2.109 134.5 121
在沒有高壓蒸汽滅菌鍋設(shè)備的情況下，可用蒸鍋、蒸籠等進(jìn)行常壓滅菌。由于密封性差，壓力升不高，溫度只能升至102℃左右因此要連續(xù)蒸4～6小時(shí)才能達(dá)到滅菌的目的。
高壓嚴(yán)菌后將試管取出排成斜面?zhèn)溆谩?br /> 母種分離材料的選擇
1. 子實(shí)體的選擇
無論是用作孢子分離或組織分離的子實(shí)體，都要從產(chǎn)量高，長(zhǎng)勢(shì)好，適應(yīng)性強(qiáng)，無雜菌蟲害的群體中，選擇朵大，生長(zhǎng)健壯的單生子實(shí)體作為分離的材料。
選作分離的子實(shí)體，成熟度要適當(dāng)，如蘑菇、草菇具有菌膜，最好選菌膜將破而未破的成熟度，這種子實(shí)體發(fā)育已成熟，子實(shí)層又未受污染，因此能很快散出大量的無菌孢子。對(duì)沒有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌，如香菇、平菇等，則以選取八分熟，正在釋放孢子的個(gè)體為最好；因?yàn)閯倧膿?dān)子彈射出來的孢子基本上也是無菌的。
2. 菇木和耳本的選擇
木生食用菌如香菇、銀耳、黑木耳等，可以從它們生長(zhǎng)的基質(zhì)，即菇木和耳木作為分離的材料。選擇時(shí)，應(yīng)從野生或人工栽培場(chǎng)所挑選子實(shí)體生長(zhǎng)健壯，朵大，長(zhǎng)勢(shì)好，菌絲在段木中發(fā)育旺盛，材質(zhì)較為結(jié)實(shí)，尚未腐爛，一般是接種后一年內(nèi)已出菇、出耳而無雜菌害蟲感染的幼齡菇木或耳木為最好。采去子實(shí)體后，截取適當(dāng)部位，掛于通風(fēng)處風(fēng)干后，供分離時(shí)用。
母種的分離方法
1. 孢子分離法
是利用食用菌的有性孢子或無性孢子，萌發(fā)成菌絲，獲得細(xì)菌種的一種方法。按分離時(shí)挑取孢子的數(shù)目不同，又分為單孢子分離法和多孢子分離法兩種。蘑菇、草菇等由于孢子沒有性的區(qū)別，采用單孢子分離獲得純菌種，有結(jié)實(shí)能力，而其它食用菌如香菇、銀耳、黑木耳等由于孢子有性別之分，單孢子分離得到的菌絲不能結(jié)實(shí)，所以，只在育種上采用，生產(chǎn)上很少采用多孢子分離法，是把許多孢子接種于同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)，自然交配而獲得純種，操作簡(jiǎn)單易學(xué)，生產(chǎn)上經(jīng)常采用。由于采集孢子的方法不同又分為如下幾種：
① 采集器孢子彈射法
采集孢子的裝置可用玻璃鐘罩或玻璃漏斗做成。蘑菇和香菇常用這種方法采集孢子。具體做法是：把玻璃鐘罩或玻璃漏斗，放在一個(gè)墊有幾層紗布的瓷 盤上，內(nèi)放培養(yǎng)皿和不銹鋼支架（漏斗內(nèi)也可倒掛鐵絲代支 架），上端通氣孔用棉花塞住，然后用二層大紗布將整個(gè)裝置包起來，高壓滅菌后；移入無菌室備用。分離時(shí)把選好的種菇（八、九分成熟），切去菌柄基部送入無菌室，用0.1％～0.2％的升汞溶液或75％的酒精表面消毒1～2分鐘后，放在無菌水中漂洗，除去表面藥液，再用滅菌紗布揩手，插到不銹鋼支架上或鐵絲構(gòu)上，靜置1～2天，菌褶上的孢子大量散落到培養(yǎng)皿內(nèi)，形成一層粉末狀孢子印時(shí)，取下種菇，用滅菌的注射器，吸取3～5毫升無菌水，注入盛有孢子的培養(yǎng)皿中，輕輕攪動(dòng)，便孢子均勻地懸浮于水上，再將注射器插上針頭，吸取沉于底部的飽滿孢子，注l～2滴懸液于試管斜面培養(yǎng)基，并使其均勻分布于培養(yǎng)基表面?；蛴媒臃N針挑取少量的孢子直接在斜面培養(yǎng)基上劃線。待孢子萌發(fā)，生成菌落時(shí)，選孢子萌發(fā)快，生長(zhǎng)良好的菌落，移接到新的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
② 三角瓶約懸法
銀耳、黑木耳常用此法采集孢子。茲以銀耳為例，介紹其具體做法如下：選朵大、雪白、無病蟲害的新鮮銀耳，作為種耳，經(jīng)無菌水漂洗種耳數(shù)次后，用無菌吸水紙把種耳表面的水分吸干。再把種耳切成一小塊，以入瓶后不會(huì)碰到瓶壁為度，掛在用火焰滅菌過的小金屬絲鉤（或不銹鋼鉤）上，迅速懸掛在三角瓶?jī)?nèi)，注意勿使種耳磁到培養(yǎng)基，以防雜菌污染。塞上棉塞，放在20～25℃條件下，經(jīng)l～2天，就可看到培 養(yǎng)基上形成一個(gè)霧狀孢子印。此時(shí)，以無菌操作把懸掛瓶?jī)?nèi)的耳片取出，再塞上棉塞，移到20～25℃的室中培養(yǎng)，經(jīng)2～3天，培養(yǎng)基表面就會(huì)出現(xiàn)許多乳白色糊狀的白落，就是銀耳的分生孢子。
采用孢子分離，要注意控制培養(yǎng)的溫度。因?yàn)槭秤镁咦拥膹椛渑c培養(yǎng)的溫度有密切關(guān)系，如雙孢蘑菇孢子彈射最適溫度是14～18℃，如培養(yǎng)在25℃條件下，孢子就很難彈出。一般食用菌孢子彈射的最適溫度比菌絲體生長(zhǎng)的最適溫度為低，而與子實(shí)體發(fā)育的最適溫度大致相同。如香菇孢子彈射的最適溫度為12～18℃，銀耳為20～24℃，黑木耳為20～26℃，平菇為13～20℃。
此外，孢子采集還可采用菌褶涂抹法，適用于野外采種，方法簡(jiǎn)便，效果也好，即選成熟的種菇，用接種針直接插入褶片間，輕輕涂抹褶片表面尚未彈射的孢子，然后在試管培養(yǎng)基上接種。
2. 組織分離法
是用食用菌幼嫩的組織塊直接分離培養(yǎng)成純菌種的方法。選用的子實(shí)體先經(jīng)0.1％開汞水或70％酒精表面消毒后。用無菌水沖洗并用無菌紗布擦去表面水分。分離香菇時(shí)用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，再用手將子實(shí)體掰開為二，在菌蓋與菌褶交界處，切取0.3～0.4立方厘米的一小塊菌肉，移放在斜面培養(yǎng)基中央。如已開傘的種菇、則選菌蓋與菌柄交界處的菌肉。分離草菇時(shí)，用無菌解剖刀把菌蕾縱切少許；再用手把菌蓋輕輕剝開，在菌柄上方和菌蓋交界處，切取1～5毫米的細(xì)塊，接在斜面培養(yǎng)基中。如種菇已受雨淋，吸水較多，應(yīng)取菌褶作為接種材料。組織分離后將試管外面放在恒溫箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍萌發(fā)出菌絲，并向 培養(yǎng)基蔓延生長(zhǎng)后，再挑取生長(zhǎng)健壯的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。組織分離法操作簡(jiǎn)便，又不易帶入雜菌，容易獲得純菌種。但對(duì)銀耳、黑木耳等膠質(zhì)菌；因其子實(shí)體中菌絲的含量極少，如用組織分離培養(yǎng)，則往往不易成功。
3. 基內(nèi)菌絲分離法
是利用食用菌生長(zhǎng)的基質(zhì)一菇木和耳木作為分離材料，而培養(yǎng)成純菌種的方法。特別是銀耳、黑木耳采用這種方法，成功率高，性狀也較穩(wěn)定，為生產(chǎn)上經(jīng)常采用的方法。具體做法是從野生或人工栽培的場(chǎng)所，選擇子實(shí)體發(fā)生早，生長(zhǎng)旺盛，朵大，無病蟲害的菇木或耳木，鋸取一小段，讓其充分風(fēng)干后備用。分離時(shí)如為香菇的菇木，先鋸取1厘米的薄片，切去四周用0.1％升汞水表面消毒1～2分 鐘，用無菌刀將其劈成小木片，再切成0.5平方厘米的小木條，移入試管斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)25～27℃培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)后，再行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。
分離時(shí)如為銀耳的耳木，先從長(zhǎng)有子實(shí)體部位，鋸取1～2厘米厚的木片，剔除樹皮及耳基，再用0.1％升汞水或70％酒精涂擦表面消毒，通過耳基著生處，把耳木縱切為二，用無菌刀在耳基著生處，削取極小的木屑，移入試管斜面培養(yǎng)基上。接種后放在20～28℃的溫度下培養(yǎng)，數(shù)天后接種塊的周 圍開始長(zhǎng)出纖細(xì)的白色菌絲，延伸到培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基的顏色逐漸變黃轉(zhuǎn)黑，表面出現(xiàn)淺灰色斑紋，這就是羽毛狀菌絲。一星期后，小木屑上出現(xiàn)白色短絨毛狀菌絲，同時(shí)分泌白色或淡黃色水珠，這就是銀耳的發(fā)育菌絲。挑取銀耳發(fā)育菌絲和少 許羽毛狀菌絲轉(zhuǎn)接于新的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)接，一星期后，菌絲長(zhǎng)滿試管，即成為母種。在實(shí)際分離中往往不可能得到銀耳菌絲與羽毛狀菌絲兩者兼有的母種?；蚣?yōu)殂y耳菌絲； 或純?yōu)橛鹈珷罹z；或酵母狀分生孢子，還有相當(dāng)數(shù)量是感染雜菌或不長(zhǎng)任何菌絲的。純銀耳菌絲和純羽毛狀菌絲，經(jīng)適當(dāng)配合后，就可應(yīng)用于生產(chǎn)。
黑木耳的耳木分離，其操作方法與銀耳大致相同，但不象銀耳有多種類型的菌絲。耳木接入試管后，一般放在22～28℃培養(yǎng)2～3天，可見菌絲長(zhǎng)出。選生長(zhǎng)健壯、清楚、兩端展整齊的，進(jìn)行轉(zhuǎn)管純化2～3次培育成母種。在培養(yǎng)過程中，有時(shí)培養(yǎng)基背面會(huì)出現(xiàn)乳白色或淡褐色，這是正?，F(xiàn)象。
母種的擴(kuò)大培養(yǎng)
從分離獲得或外地引入的優(yōu)良母種，由于數(shù)量有限不能滿足生產(chǎn)上的需要，應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)。其方法是以無菌操作把斜面培養(yǎng)基連同菌絲體切成短米粒大的小塊，移接到新的斜面培養(yǎng)基上，在適溫條件下培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面時(shí)即成。一般每支母種試管可擴(kuò)大繁殖60～80支新管。擴(kuò)大母種第一次應(yīng)多些，以避免多次轉(zhuǎn)管，造成菌絲生活力降低，結(jié)菇（耳）少，影響產(chǎn)量和質(zhì)量。一般要求轉(zhuǎn)管不要超過五次。
1. 母種培養(yǎng)基的種類
母種是菌種生產(chǎn)的關(guān)鍵，要求純度高，不能混生雜菌，同時(shí)母種的菌絲體較為纖細(xì)，分解培養(yǎng)料的能力較弱。因此，母種菌絲體需要培養(yǎng)在營養(yǎng)豐富，易被吸收，表面光滑易于鑒別有無雜菌感染的瓊脂培養(yǎng)基上。適合母種菌絲生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基種類很多，常用的有下列幾種：
① 馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 馬鈴薯（去皮） 200克 瓊脂 20克 葡萄糖（或蔗糖） 20克 水 1000毫升
?、?麥芽汁—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 干麥芽 250克 瓊脂 15～20克 葡萄糖（或蔗糖） 10克 水 1000毫升
?、?胡蘿卜—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 胡蘿卜 100克 瓊脂 20克 葡萄糖（或蔗糖） 20克 水 1000毫升
?、?蘑菇汁—葡萄糖一瓊脂培養(yǎng)基（適用于蘑菇）： 鮮蘑菇 250克 瓊脂 20克 葡萄糖（或蔗糖） 20克 水 1000毫升
?、?蛋白胨—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基： 蛋白胨 2克 葡萄糖 20克 磷酸氫二鉀 2克 維生素B1（硫胺素） 0.5毫克 磷酸二氫鉀 0.5克 瓊脂 18克 硫酸鎂 0.5克 水 l000毫升
2. 母種培養(yǎng)基的制法
以最常用的馬鈴薯—葡萄糖—瓊脂培養(yǎng)基的制法為例介紹如下：先將馬鈴薯去皮，洗滌，切成小塊加水1000毫升，煮沸15～20分鐘，取雙層紗布過濾，取其濾液，加入瓊脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加熱使其溶化，最后補(bǔ)足水分，使其容量仍為1000毫升。趁熱分裝于試管中，裝量約為試管長(zhǎng)度的1/5左右，裝管時(shí)要注意不使培養(yǎng)基沾污試管壁和試管口。試管口塞上大小合適的棉花塞，塞入試管口內(nèi)的長(zhǎng)度為棉塞總長(zhǎng)的3/5。塞好棉塞后，每10支作一捆，用牛皮紙包扎好后，置鐵絲網(wǎng)籠中，然后進(jìn)行高壓滅菌。如作為孢子分離用，則將培養(yǎng)基分裝于三角瓶或培養(yǎng)皿中，然后高壓滅菌。
3. 母種培養(yǎng)基的消毒滅菌
母種培養(yǎng)基通常用高壓蒸汽滅菌鍋來消毒滅菌，常用的高壓蒸汽滅菌鍋有直式、臥式和手提式三種。將配制好后的母種培養(yǎng)基移入上述任何一種高壓蒸汽滅菌鍋中，在15公斤/平方厘米 壓力下，消毒滅菌30分鐘。
高壓蒸汽滅菌主要是依靠提高蒸汽的溫度來滅菌的，因此滅菌時(shí)，應(yīng)將鍋內(nèi)的冷空氣全部排除。否則，盡管壓力表上的壓力已達(dá)到要求，然而，滅菌鍋內(nèi)的溫度卻未達(dá)到所需的溫度（表11）。排除冷空氣的方法是加熱后當(dāng)壓力表上指針上升到0.5公斤/平方厘米時(shí)，打開排氣閥，放氣至指針仍回到“零”的位置。滅菌的時(shí)間是以排除冷空氣后，壓力回升到1.5公斤/平方厘米 時(shí)才開始計(jì)算。每次滅菌之后，要等壓力降到“零”時(shí)，才打開鍋蓋，否則，滅菌的液體會(huì)因突然減壓而外溢，玻璃器皿也會(huì)因突然降溫而破裂。
下表高壓滅菌時(shí)壓力的換算及其與溫度的關(guān)系 ：
磅/平方英寸 公斤/平方厘米 滅菌器中的溫度（℃）
排除空氣 未排除空氣
5 0.352 108.4 72
10 0.703 115.2 90
15 1.055 121.0 100
20 1.406 126.0 109
25 1.758 130.4 115
30 2.109 134.5 121
在沒有高壓蒸汽滅菌鍋設(shè)備的情況下，可用蒸鍋、蒸籠等進(jìn)行常壓滅菌。由于密封性差，壓力升不高，溫度只能升至102℃左右因此要連續(xù)蒸4～6小時(shí)才能達(dá)到滅菌的目的。
高壓嚴(yán)菌后將試管取出排成斜面?zhèn)溆谩?br /> 母種分離材料的選擇
1. 子實(shí)體的選擇
無論是用作孢子分離或組織分離的子實(shí)體，都要從產(chǎn)量高，長(zhǎng)勢(shì)好，適應(yīng)性強(qiáng)，無雜菌蟲害的群體中，選擇朵大，生長(zhǎng)健壯的單生子實(shí)體作為分離的材料。
選作分離的子實(shí)體，成熟度要適當(dāng)，如蘑菇、草菇具有菌膜，最好選菌膜將破而未破的成熟度，這種子實(shí)體發(fā)育已成熟，子實(shí)層又未受污染，因此能很快散出大量的無菌孢子。對(duì)沒有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌，如香菇、平菇等，則以選取八分熟，正在釋放孢子的個(gè)體為最好；因?yàn)閯倧膿?dān)子彈射出來的孢子基本上也是無菌的。
2. 菇木和耳本的選擇
木生食用菌如香菇、銀耳、黑木耳等，可以從它們生長(zhǎng)的基質(zhì)，即菇木和耳木作為分離的材料。選擇時(shí)，應(yīng)從野生或人工栽培場(chǎng)所挑選子實(shí)體生長(zhǎng)健壯，朵大，長(zhǎng)勢(shì)好，菌絲在段木中發(fā)育旺盛，材質(zhì)較為結(jié)實(shí)，尚未腐爛，一般是接種后一年內(nèi)已出菇、出耳而無雜菌害蟲感染的幼齡菇木或耳木為最好。采去子實(shí)體后，截取適當(dāng)部位，掛于通風(fēng)處風(fēng)干后，供分離時(shí)用。
母種的分離方法
1. 孢子分離法
是利用食用菌的有性孢子或無性孢子，萌發(fā)成菌絲，獲得細(xì)菌種的一種方法。按分離時(shí)挑取孢子的數(shù)目不同，又分為單孢子分離法和多孢子分離法兩種。蘑菇、草菇等由于孢子沒有性的區(qū)別，采用單孢子分離獲得純菌種，有結(jié)實(shí)能力，而其它食用菌如香菇、銀耳、黑木耳等由于孢子有性別之分，單孢子分離得到的菌絲不能結(jié)實(shí)，所以，只在育種上采用，生產(chǎn)上很少采用多孢子分離法，是把許多孢子接種于同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)，自然交配而獲得純種，操作簡(jiǎn)單易學(xué)，生產(chǎn)上經(jīng)常采用。由于采集孢子的方法不同又分為如下幾種：
① 采集器孢子彈射法
采集孢子的裝置可用玻璃鐘罩或玻璃漏斗做成。蘑菇和香菇常用這種方法采集孢子。具體做法是：把玻璃鐘罩或玻璃漏斗，放在一個(gè)墊有幾層紗布的瓷 盤上，內(nèi)放培養(yǎng)皿和不銹鋼支架（漏斗內(nèi)也可倒掛鐵絲代支 架），上端通氣孔用棉花塞住，然后用二層大紗布將整個(gè)裝置包起來，高壓滅菌后；移入無菌室備用。分離時(shí)把選好的種菇（八、九分成熟），切去菌柄基部送入無菌室，用0.1％～0.2％的升汞溶液或75％的酒精表面消毒1～2分鐘后，放在無菌水中漂洗，除去表面藥液，再用滅菌紗布揩手，插到不銹鋼支架上或鐵絲構(gòu)上，靜置1～2天，菌褶上的孢子大量散落到培養(yǎng)皿內(nèi)，形成一層粉末狀孢子印時(shí)，取下種菇，用滅菌的注射器，吸取3～5毫升無菌水，注入盛有孢子的培養(yǎng)皿中，輕輕攪動(dòng)，便孢子均勻地懸浮于水上，再將注射器插上針頭，吸取沉于底部的飽滿孢子，注l～2滴懸液于試管斜面培養(yǎng)基，并使其均勻分布于培養(yǎng)基表面?；蛴媒臃N針挑取少量的孢子直接在斜面培養(yǎng)基上劃線。待孢子萌發(fā)，生成菌落時(shí)，選孢子萌發(fā)快，生長(zhǎng)良好的菌落，移接到新的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
② 三角瓶約懸法
銀耳、黑木耳常用此法采集孢子。茲以銀耳為例，介紹其具體做法如下：選朵大、雪白、無病蟲害的新鮮銀耳，作為種耳，經(jīng)無菌水漂洗種耳數(shù)次后，用無菌吸水紙把種耳表面的水分吸干。再把種耳切成一小塊，以入瓶后不會(huì)碰到瓶壁為度，掛在用火焰滅菌過的小金屬絲鉤（或不銹鋼鉤）上，迅速懸掛在三角瓶?jī)?nèi)，注意勿使種耳磁到培養(yǎng)基，以防雜菌污染。塞上棉塞，放在20～25℃條件下，經(jīng)l～2天，就可看到培 養(yǎng)基上形成一個(gè)霧狀孢子印。此時(shí)，以無菌操作把懸掛瓶?jī)?nèi)的耳片取出，再塞上棉塞，移到20～25℃的室中培養(yǎng)，經(jīng)2～3天，培養(yǎng)基表面就會(huì)出現(xiàn)許多乳白色糊狀的白落，就是銀耳的分生孢子。
采用孢子分離，要注意控制培養(yǎng)的溫度。因?yàn)槭秤镁咦拥膹椛渑c培養(yǎng)的溫度有密切關(guān)系，如雙孢蘑菇孢子彈射最適溫度是14～18℃，如培養(yǎng)在25℃條件下，孢子就很難彈出。一般食用菌孢子彈射的最適溫度比菌絲體生長(zhǎng)的最適溫度為低，而與子實(shí)體發(fā)育的最適溫度大致相同。如香菇孢子彈射的最適溫度為12～18℃，銀耳為20～24℃，黑木耳為20～26℃，平菇為13～20℃。
此外，孢子采集還可采用菌褶涂抹法，適用于野外采種，方法簡(jiǎn)便，效果也好，即選成熟的種菇，用接種針直接插入褶片間，輕輕涂抹褶片表面尚未彈射的孢子，然后在試管培養(yǎng)基上接種。
2. 組織分離法
是用食用菌幼嫩的組織塊直接分離培養(yǎng)成純菌種的方法。選用的子實(shí)體先經(jīng)0.1％開汞水或70％酒精表面消毒后。用無菌水沖洗并用無菌紗布擦去表面水分。分離香菇時(shí)用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，再用手將子實(shí)體掰開為二，在菌蓋與菌褶交界處，切取0.3～0.4立方厘米的一小塊菌肉，移放在斜面培養(yǎng)基中央。如已開傘的種菇、則選菌蓋與菌柄交界處的菌肉。分離草菇時(shí)，用無菌解剖刀把菌蕾縱切少許；再用手把菌蓋輕輕剝開，在菌柄上方和菌蓋交界處，切取1～5毫米的細(xì)塊，接在斜面培養(yǎng)基中。如種菇已受雨淋，吸水較多，應(yīng)取菌褶作為接種材料。組織分離后將試管外面放在恒溫箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍萌發(fā)出菌絲，并向 培養(yǎng)基蔓延生長(zhǎng)后，再挑取生長(zhǎng)健壯的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。組織分離法操作簡(jiǎn)便，又不易帶入雜菌，容易獲得純菌種。但對(duì)銀耳、黑木耳等膠質(zhì)菌；因其子實(shí)體中菌絲的含量極少，如用組織分離培養(yǎng)，則往往不易成功。
3. 基內(nèi)菌絲分離法
是利用食用菌生長(zhǎng)的基質(zhì)一菇木和耳木作為分離材料，而培養(yǎng)成純菌種的方法。特別是銀耳、黑木耳采用這種方法，成功率高，性狀也較穩(wěn)定，為生產(chǎn)上經(jīng)常采用的方法。具體做法是從野生或人工栽培的場(chǎng)所，選擇子實(shí)體發(fā)生早，生長(zhǎng)旺盛，朵大，無病蟲害的菇木或耳木，鋸取一小段，讓其充分風(fēng)干后備用。分離時(shí)如為香菇的菇木，先鋸取1厘米的薄片，切去四周用0.1％升汞水表面消毒1～2分 鐘，用無菌刀將其劈成小木片，再切成0.5平方厘米的小木條，移入試管斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)25～27℃培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)后，再行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。
分離時(shí)如為銀耳的耳木，先從長(zhǎng)有子實(shí)體部位，鋸取1～2厘米厚的木片，剔除樹皮及耳基，再用0.1％升汞水或70％酒精涂擦表面消毒，通過耳基著生處，把耳木縱切為二，用無菌刀在耳基著生處，削取極小的木屑，移入試管斜面培養(yǎng)基上。接種后放在20～28℃的溫度下培養(yǎng)，數(shù)天后接種塊的周 圍開始長(zhǎng)出纖細(xì)的白色菌絲，延伸到培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基的顏色逐漸變黃轉(zhuǎn)黑，表面出現(xiàn)淺灰色斑紋，這就是羽毛狀菌絲。一星期后，小木屑上出現(xiàn)白色短絨毛狀菌絲，同時(shí)分泌白色或淡黃色水珠，這就是銀耳的發(fā)育菌絲。挑取銀耳發(fā)育菌絲和少 許羽毛狀菌絲轉(zhuǎn)接于新的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)接，一星期后，菌絲長(zhǎng)滿試管，即成為母種。在實(shí)際分離中往往不可能得到銀耳菌絲與羽毛狀菌絲兩者兼有的母種?；蚣?yōu)殂y耳菌絲； 或純?yōu)橛鹈珷罹z；或酵母狀分生孢子，還有相當(dāng)數(shù)量是感染雜菌或不長(zhǎng)任何菌絲的。純銀耳菌絲和純羽毛狀菌絲，經(jīng)適當(dāng)配合后，就可應(yīng)用于生產(chǎn)。
黑木耳的耳木分離，其操作方法與銀耳大致相同，但不象銀耳有多種類型的菌絲。耳木接入試管后，一般放在22～28℃培養(yǎng)2～3天，可見菌絲長(zhǎng)出。選生長(zhǎng)健壯、清楚、兩端展整齊的，進(jìn)行轉(zhuǎn)管純化2～3次培育成母種。在培養(yǎng)過程中，有時(shí)培養(yǎng)基背面會(huì)出現(xiàn)乳白色或淡褐色，這是正?，F(xiàn)象。
母種的擴(kuò)大培養(yǎng)
從分離獲得或外地引入的優(yōu)良母種，由于數(shù)量有限不能滿足生產(chǎn)上的需要，應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)。其方法是以無菌操作把斜面培養(yǎng)基連同菌絲體切成短米粒大的小塊，移接到新的斜面培養(yǎng)基上，在適溫條件下培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿斜面時(shí)即成。一般每支母種試管可擴(kuò)大繁殖60～80支新管。擴(kuò)大母種第一次應(yīng)多些，以避免多次轉(zhuǎn)管，造成菌絲生活力降低，結(jié)菇（耳）少，影響產(chǎn)量和質(zhì)量。一般要求轉(zhuǎn)管不要超過五次。
