大球蓋菇菌種生產(chǎn)方法和蘑菇、草菇菌種生產(chǎn)方法基本相同，可用組織分離法和孢子分離法獲得純菌種（大面積使用前應(yīng)做出菇試驗(yàn)），新區(qū)主要靠引進(jìn)母種或原種。適合大球蓋菇母種生產(chǎn)的培養(yǎng)基如下：
　　一、母種培養(yǎng)基
　　1、麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基(MYA)大豆蛋白胨(豆胨)1克、酵母2克、麥芽糖20克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
　　2、馬鈴薯葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基(PDYA)馬鈴薯300克(加水1500毫升，煮20分鐘，用濾汁)、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
　　3、燕麥粉麥芽糖酵母瓊脂培養(yǎng)基(DMYA)燕麥粉80克、麥芽糖10克、酵母2克、瓊脂20克，加水至1000毫升。
　　上述3種配方中如不加瓊脂，即可作為液體培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基需按常規(guī)配制、分裝、滅菌、接種和培養(yǎng)。
　　二、原種和栽培種培養(yǎng)基
　　1、小麥稈或裸麥稈，切碎(長(zhǎng)2—3厘米)，泡濕，裝瓶，高壓滅菌后備用。
　　2、小麥、裸麥，高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至沒有白芯但表皮不破，加2%碳酸鈣，裝瓶，高壓滅菌后備用。
　　3、木屑和小木片各40%、麩皮20%，制作栽培種培養(yǎng)基。
　　還可用平菇或金針菇下腳料作培養(yǎng)基重新滅菌后備用。
　　三、接種
　　可以用培養(yǎng)3—4天的液體菌種接種。若用固體菌種必須加大接種量(菌種/培養(yǎng)料)，接種量最少10%，最好15%—20%。
　　四、培養(yǎng)
　　接種后，把菌種瓶或袋放在20—28℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)。大球蓋菇菌絲生長(zhǎng)幾天后，菌絲生長(zhǎng)速度會(huì)逐漸緩慢，加速菌絲生長(zhǎng)的方法是攪拌。用液體菌種接種的無菌麥粒培養(yǎng)基，每隔3—7天搖瓶一次，把菌絲搖斷，可以刺激菌絲再生，能保證菌絲生長(zhǎng)旺盛。