我所經(jīng)過多年研究，人工馴化栽培蛹蟲草獲得成功，并實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)。但在生產(chǎn)實(shí)踐中，我們遇到了一個普遍性的難題，就是蛹蟲草菌種的遺傳變異顯著，優(yōu)良性狀不能完全穩(wěn)定遺傳，且極易老化或退化。一般來說，從野生蛹蟲草菌株中分離的一個較好菌株，幸運(yùn)的話可能會使用1～2年，保持優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。但通常是使用半年左右，甚至是傳種幾代后菌種就嚴(yán)重退化，表現(xiàn)特征是不長或只長出極少量子實(shí)體，而且質(zhì)量極差，給批量栽培帶來極大的風(fēng)險。為了降低這種因菌種退化而帶來的風(fēng)險，我們在菌種復(fù)壯方面做了大量工作，獲得了適合于蛹蟲草菌種復(fù)壯的較好方法?，F(xiàn)介紹如下，供廣大同行參考。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
?、?菌株cm-A，由本實(shí)驗(yàn)室提供。
?、?培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：
培養(yǎng)基配方：1000mL培養(yǎng)基中土豆200g，蔗糖30g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鉀3g，VB1，1mg。最后調(diào)pH為6～6.5（固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉即可）。土豆去皮后稱200g，切小塊，煮開后繼續(xù)煮0.5h，4～5層紗布過濾，高壓滅菌30min。
培養(yǎng)條件：24～25℃靜止培養(yǎng)2d后，120r/min，培養(yǎng)5d。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 組織分離法 選無雜菌的罐頭瓶中長度2～3cm狀態(tài)好的子實(shí)體，用無菌水沖洗，刮掉表層，取肉質(zhì)1mm大小于斜面培養(yǎng)基上，24～25℃培養(yǎng)15d，菌絲布滿斜面，再經(jīng)子實(shí)體栽培，反復(fù)篩選，得到菌株cm～B。
1.2.2 孢子分離法 選擇形態(tài)好、生長勢健壯并能代表該品種性狀的接近成熟子實(shí)體，懸掛式采孢子于PDA固體培養(yǎng)基上，24～25℃培養(yǎng)成單個菌落，再將單個菌落移到斜面培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)到菌絲布滿斜面。然后經(jīng)子實(shí)體栽培，反復(fù)篩選，得到菌株cm-C。
1.2.3 蟲體回接法 將試驗(yàn)室保存的母種cm-A接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成菌懸液5層紗布過濾，濾液待用。取剛化蛹的柞蠶蛹，用75%乙醇消毒。用醫(yī)用注射器將上述菌液注射到蛹體內(nèi)，24～25℃培養(yǎng)變成僵蛹。取長滿菌絲的體內(nèi)組織粒到PDA斜面，24～25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)到菌絲布滿斜面，再分離純化得到菌株cm-D。
1.2.4 耐高溫試驗(yàn) 將復(fù)壯后的新菌株各取1支試管種置34℃恒溫箱24h。
1.2.5 菌絲生長試驗(yàn) 將復(fù)壯后的新菌株及親本菌株各取一小塊接種到盛有PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，24～25℃下培養(yǎng)3d開始觀察，觀察10d后結(jié)束試驗(yàn)。
1.2.6 子實(shí)體栽培 取cm-A、cm-B、cm-C、cm-D相同大小、數(shù)量的菌塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，24～25℃靜止培養(yǎng)2d后，120r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d，接種米飯罐頭瓶中，每個測試樣30瓶，相同管理?xiàng)l件下培養(yǎng)、觀察，計算平均單瓶產(chǎn)量（鮮重）。
2 結(jié)果與分析
2.1 耐高溫試驗(yàn) 將復(fù)壯菌株cm-B、cm-C、cm-D試管菌絲置34℃恒溫箱24h，未發(fā)現(xiàn)吐黃水，但生長速度變得緩慢，重新置24℃環(huán)境中，恢復(fù)了原有的生長速度，說明復(fù)壯菌株能耐一定高溫。
2.2 菌絲生長情況 cm-B、cm-C、cm-D與親本cm-A相比，菌絲日平均生長量都有提高，具體見表1。
表1 菌種復(fù)壯前后菌絲生長情況（mm）
菌 株 cm-A cm-B cm-C cm-D
日均生長 4.12 5.21 5.51 5.84
2.3 子實(shí)體栽培試驗(yàn) 三種方法復(fù)壯的菌種經(jīng)子實(shí)體栽培試驗(yàn)，通過觀察比較，發(fā)現(xiàn)cm-D轉(zhuǎn)色最快，cm-B及cm-C次之。出草天數(shù)均提前4～5d，而且子實(shí)體比較均勻，且個數(shù)多，從而產(chǎn)量也有明顯的提高。具體見表2。
3 討論
通過上述試驗(yàn)，可以看出，蛹蟲草的菌種復(fù)壯采用這三種方法均是可行的。但因蛹蟲草菌種要求外界條件嚴(yán)格，受外界因素影響明顯，僅以常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)壯，還不能真正解決菌種退化問題。目前，研究發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞產(chǎn)生的脫氫酶與細(xì)胞活力成正比，通過對脫氫酶的測定來提早淘汰退化菌株，減少損失。下一步我們主要從遺傳物質(zhì)DNA入手，通過分子標(biāo)記技術(shù)RFLP和RAPA。比較正常菌株和退化菌株在基因水平的變異情況，利用電泳圖譜觀察與退化特征相聯(lián)系的特異條帶，確定突變基因，想辦法“治療”發(fā)生變異的基因，最終找到一種很好的解決菌種退化問題的辦法。
表2 菌種復(fù)壯前后子實(shí)體栽培情況
菌 株 cm-A cm-B cm-C cm-D
轉(zhuǎn)色 一般 快 快 快
出草天數(shù)（d） 16 10 12 10
產(chǎn)量（s/瓶） 15.5 20.1 22.3 19.8
遼寧省農(nóng)科院大連生物技術(shù)研究所,李亞潔 王鶴 孟楠 石理鑫 王林華
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
?、?菌株cm-A，由本實(shí)驗(yàn)室提供。
?、?培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：
培養(yǎng)基配方：1000mL培養(yǎng)基中土豆200g，蔗糖30g，硫酸鎂1.5g，磷酸二氫鉀3g，VB1，1mg。最后調(diào)pH為6～6.5（固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉即可）。土豆去皮后稱200g，切小塊，煮開后繼續(xù)煮0.5h，4～5層紗布過濾，高壓滅菌30min。
培養(yǎng)條件：24～25℃靜止培養(yǎng)2d后，120r/min，培養(yǎng)5d。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 組織分離法 選無雜菌的罐頭瓶中長度2～3cm狀態(tài)好的子實(shí)體，用無菌水沖洗，刮掉表層，取肉質(zhì)1mm大小于斜面培養(yǎng)基上，24～25℃培養(yǎng)15d，菌絲布滿斜面，再經(jīng)子實(shí)體栽培，反復(fù)篩選，得到菌株cm～B。
1.2.2 孢子分離法 選擇形態(tài)好、生長勢健壯并能代表該品種性狀的接近成熟子實(shí)體，懸掛式采孢子于PDA固體培養(yǎng)基上，24～25℃培養(yǎng)成單個菌落，再將單個菌落移到斜面培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)到菌絲布滿斜面。然后經(jīng)子實(shí)體栽培，反復(fù)篩選，得到菌株cm-C。
1.2.3 蟲體回接法 將試驗(yàn)室保存的母種cm-A接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成菌懸液5層紗布過濾，濾液待用。取剛化蛹的柞蠶蛹，用75%乙醇消毒。用醫(yī)用注射器將上述菌液注射到蛹體內(nèi)，24～25℃培養(yǎng)變成僵蛹。取長滿菌絲的體內(nèi)組織粒到PDA斜面，24～25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)到菌絲布滿斜面，再分離純化得到菌株cm-D。
1.2.4 耐高溫試驗(yàn) 將復(fù)壯后的新菌株各取1支試管種置34℃恒溫箱24h。
1.2.5 菌絲生長試驗(yàn) 將復(fù)壯后的新菌株及親本菌株各取一小塊接種到盛有PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，24～25℃下培養(yǎng)3d開始觀察，觀察10d后結(jié)束試驗(yàn)。
1.2.6 子實(shí)體栽培 取cm-A、cm-B、cm-C、cm-D相同大小、數(shù)量的菌塊接種到PDA液體培養(yǎng)基中，24～25℃靜止培養(yǎng)2d后，120r/min搖床振蕩培養(yǎng)5d，接種米飯罐頭瓶中，每個測試樣30瓶，相同管理?xiàng)l件下培養(yǎng)、觀察，計算平均單瓶產(chǎn)量（鮮重）。
2 結(jié)果與分析
2.1 耐高溫試驗(yàn) 將復(fù)壯菌株cm-B、cm-C、cm-D試管菌絲置34℃恒溫箱24h，未發(fā)現(xiàn)吐黃水，但生長速度變得緩慢，重新置24℃環(huán)境中，恢復(fù)了原有的生長速度，說明復(fù)壯菌株能耐一定高溫。
2.2 菌絲生長情況 cm-B、cm-C、cm-D與親本cm-A相比，菌絲日平均生長量都有提高，具體見表1。
表1 菌種復(fù)壯前后菌絲生長情況（mm）
菌 株 cm-A cm-B cm-C cm-D
日均生長 4.12 5.21 5.51 5.84
2.3 子實(shí)體栽培試驗(yàn) 三種方法復(fù)壯的菌種經(jīng)子實(shí)體栽培試驗(yàn)，通過觀察比較，發(fā)現(xiàn)cm-D轉(zhuǎn)色最快，cm-B及cm-C次之。出草天數(shù)均提前4～5d，而且子實(shí)體比較均勻，且個數(shù)多，從而產(chǎn)量也有明顯的提高。具體見表2。
3 討論
通過上述試驗(yàn)，可以看出，蛹蟲草的菌種復(fù)壯采用這三種方法均是可行的。但因蛹蟲草菌種要求外界條件嚴(yán)格，受外界因素影響明顯，僅以常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)壯，還不能真正解決菌種退化問題。目前，研究發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞產(chǎn)生的脫氫酶與細(xì)胞活力成正比，通過對脫氫酶的測定來提早淘汰退化菌株，減少損失。下一步我們主要從遺傳物質(zhì)DNA入手，通過分子標(biāo)記技術(shù)RFLP和RAPA。比較正常菌株和退化菌株在基因水平的變異情況，利用電泳圖譜觀察與退化特征相聯(lián)系的特異條帶，確定突變基因，想辦法“治療”發(fā)生變異的基因，最終找到一種很好的解決菌種退化問題的辦法。
表2 菌種復(fù)壯前后子實(shí)體栽培情況
菌 株 cm-A cm-B cm-C cm-D
轉(zhuǎn)色 一般 快 快 快
出草天數(shù)（d） 16 10 12 10
產(chǎn)量（s/瓶） 15.5 20.1 22.3 19.8
遼寧省農(nóng)科院大連生物技術(shù)研究所,李亞潔 王鶴 孟楠 石理鑫 王林華
