作者：劉 紅 黃建軍 許麗娟 魏小武 《現代農業(yè)科技》 2008年第18期
摘要 對食用菌菌種保藏的目的意義、基本原理、方法及效果鑒定進行了介紹，以便為廣大食用菌生產者的菌種保藏工作提供參考。
關鍵詞 食用菌；菌種保藏；斜面菌種；非斜面固體菌種
中圖分類號 S646.032 文獻標識碼A文章編號1007-5739（2008）18-0122-02
菌種是國家重要的生物資源，是生產、教學和科學研究的基本材料。食用菌和其他生物一樣，具有遺傳性和變異性，菌種保藏過程中，不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染，更主要的是保持菌種遺傳性狀不發(fā)生或盡可能少發(fā)生變異。一個優(yōu)良的食用菌菌種被選育出來以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產性能，才能長期在生產中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產上具有重要的意義。為適應群眾性生產的需要，使優(yōu)良高產菌株盡可能長時間地在生產上發(fā)揮作用，并降低菌種的衰亡速度，防止雜菌污染，確保菌種的純正，現對食用菌菌種的保藏做一簡介，并介紹幾種簡單易行、實用效果好的菌種保藏方法。
1 食用菌菌種保藏的目的意義及基本原理
菌種保藏的主要目的在于能在較長時間內保持菌種的生存，保持菌種在遺傳、形態(tài)和生理上的穩(wěn)定性。對于生產用的商業(yè)品種，就是要保持其生產性狀的穩(wěn)定性。同時，還要保持菌種的物種獨立性，即使其免受其他微生物的侵染，保持純培養(yǎng)狀態(tài)。因此，它與新品種的選育具有同等的重要性。特別是在目前國內菌種分散生產的情況下，菌種來源不清，菇農之間菌種誤傳，某些菇農和科研單位毫無根據地命名，使菌種出現同名異物或同物異名的現象，造成了菇農選擇菌種的困難。而菌種的保藏和管理有利于這些問題的緩解。
菌種保藏的方法很多，但原理大同小異，均是通過低溫、干燥、缺氧和饑餓等手段來達到最大限度降低菌絲體的生理代謝。首先要挑選優(yōu)良純菌種，包括菌絲體和它們的孢子；其次，根據其生理、生化特點，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的性狀，防止變異。不管采用哪種保藏方法，在菌種保存過程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。
2 食用菌菌種保藏的方法
2.1 試管斜面菌種系列保存方法
2.1.1 低溫定期移植保藏法。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)，當菌絲健壯地長滿斜面時取出，放在3~5℃低溫干燥處或4℃冰箱中保藏，每隔3~6個月移植轉管1次，具體應根據菌種特性決定。保藏時要注意環(huán)境濕度不能太高，以防霉菌通過棉塞進入管內。因此，若用棉塞，可用干凈的塑料薄膜或牛皮紙包扎棉塞，也可用無菌的白膠塞，并用石蠟涂封，即可減少污染的機會，也可防止培養(yǎng)基干燥。除草菇外，大多食用菌菌種都能采用此法保藏。
2.1.2 液體石蠟保藏法。取化學純液體石蠟裝于三角瓶中高壓滅菌后，放入40℃恒溫箱中，蒸發(fā)其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上，28～30℃下培養(yǎng)2～3d，證明無雜菌生長方可使用。然后將母種接在斜面培養(yǎng)基上，當菌絲在斜面上生長豐滿后，將液體石蠟注在斜面上，注入量以高出斜面1cm為宜，使菌種與空氣隔絕，降低其新陳代謝能力。管口用滅過菌的白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，直立放在室內干燥處或冰箱內保藏。一般可保存1年以上，在低溫下保藏時間還可延長。使用時從斜面上挑取菌絲少許，移接到新鮮斜面培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)即可。由于菌絲體沾有液體石蠟而影響其生長，需再經1次移接才能恢復正常生長。
2.1.3 白膠塞封口保存法。選擇與試管口徑相符的白膠塞，用0.2%煤酚皂溶液洗滌，浸泡在酒精內待用。當試管斜面長滿菌絲后，在無菌條件下拔去棉塞，取浸泡的白膠塞1個，通過火焰迅速塞入試管口內，并用石蠟熔封。此法能達到與石蠟油封存相似的效果。用該法保存菌種可存活1～3年，但以每年移植1次為好。
2.1.4 蒸餾水保藏法。將8成熟試管菌種放在接種箱內，注入蒸餾水，將培養(yǎng)基斜面全部淹沒至管口2cm。管口用白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，常溫下置于陰涼處立放，可以保藏1年左右。
2.2 非斜面固體菌種系列保存法
2.2.1 麥麩保藏法。將麥麩和水按0.80∶1充分拌勻后，裝入試管高壓滅菌，經無菌檢查合格后接種，適溫下培養(yǎng)至菌絲體發(fā)育好后，將試管放入真空干燥器內，用真空泵將麥麩培養(yǎng)基內水分抽干，然后移入盛有硅膠的干燥器內，用凡士林密封在常溫下保存，可保藏3～5年。
2.2.2 麥粒保藏法。取優(yōu)質小麥，淘洗后浸入20℃水中5h，撈出稍晾干，裝入試管，占管深1/3，高壓滅菌后趁熱搖散，冷卻后接入菌絲體，適溫培養(yǎng)至菌絲長滿基質后用石蠟封棉塞，置于冰箱或20℃以下干燥處，可保藏1～2年。
2.2.3 木屑保藏法。將闊葉樹木屑78％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏粉1％，混合后加水拌勻，裝入試管滅菌后，接入斜面菌種，在適溫下培養(yǎng)，待菌絲長至試管2/3時用石蠟封棉塞，置低溫或常溫下保藏，一般可保藏1~ 2年。
2.2.4 稻草粉保存草菇菌種。草菇斜面菌種在2～4℃下保存2d便失去生活力，室溫下保存又因斜面培養(yǎng)基失水太快影響菌種存活。用稻草粉保存草菇菌種有其獨特的優(yōu)越性。其配方為稻草粉75%、麥麩22%、石膏粉1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%、適量的水拌勻調濕。裝入試管高壓滅菌后按常規(guī)接種培養(yǎng)，當菌絲長到試管2/3時，管口棉塞用石蠟熔封。常溫下保存至次年，不影響其活力和種性。
2.3 液體系列菌種保存法
2.3.1 生理鹽水保藏法。將待保藏的菌種接入馬鈴薯培養(yǎng)液中，在250mL三角形瓶中裝60mL培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)或每天搖動5～10次，培養(yǎng)5～7d，然后將形成的菌絲球用無菌吸管吸入裝有５mL無菌生理鹽水試管中，每管移入4～5個菌絲球，塞上無菌白膠塞，用石蠟涂封，置低溫下可保藏1～2年。
2.3.2 營養(yǎng)液保存法。營養(yǎng)液的配方為馬鈴薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、硫酸銨微量。每支試管內裝5mL，滅菌后用無菌吸管吸取生理鹽水保藏法深層培養(yǎng)的菌絲球4～5個于試管中，10~25℃的室溫下保存，可存活2～3年，其保存效果優(yōu)于生理鹽水保存法。不影響菌株形成子實體的能力。
2.3.3 無菌水保存法。先將培養(yǎng)好的斜面菌種切成小塊，連同培養(yǎng)基移入盛有適量無菌蒸餾水的試管中，然后用白膠塞封口，在20℃左右的室溫下保存?？纱婊?～2年。也可用磷酸緩沖液做保存液，其緩沖液的pH值視各保存菌株生長的酸堿度而定。該法操作簡便易行。
2.4 利用孢子保存菌種系列方法
2.4.1 濾紙片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）濾紙，剪成4.0cm×0.8cm的小紙條，平鋪在培養(yǎng)皿中用紙包裹進行滅菌。采用鉤懸法收集孢子，讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中，白膠塞封口，再將保藏試管放入干燥器中1～2d，除去濾紙水分，然后低溫保藏。保存期可達２～10年。
2.4.2 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗滌數次，過60目篩除去粗粒，加用1％稀鹽酸煮沸30min，以除去其中的有機質，再用水沖洗至pH值達到中性，烘干備用。同時取非耕作層的瘦黃土或紅土，用水反復沖洗至中性，烘干碾細，過100目篩，將處理好的沙與土以2～4∶1混勻，然后分裝小試管內，每管裝0.5g，高壓滅菌（1.5kg/cm2）3次，再干熱滅菌（160℃，2h）1次，待無菌檢驗合格后方可使用。將已形成孢子的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌水3mL，刮菌苔，制成菌懸液，再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內，接上真空泵抽氣至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48h內完成，以免孢子發(fā)芽。制備好的沙土管石蠟封口，在低溫下可保藏2～10年。
此外，還有甘油保藏法、枝條保藏法、超低溫液氮保藏法、冷凍真空干燥法等。
菌種保藏方法雖多，但都存在一些缺點，需進一步進行研究和探討。其中低溫定期移植保藏法雖然簡單易行，不需特殊設備，但需幾個月轉管1次，轉管的次數多了，變異的可能性就增大，易造成菌種衰退。近年來人們找到了一種目前認為最有效廣譜安全的保藏方法——超低溫液氮保藏法，在ATCC 用這種方法保藏雙孢蘑菇，9年后菌種仍保持穩(wěn)定，用于生產，產量、質量無大變化，是目前國際上公認為較為理想的菌種保藏方法，但用這種方法保藏菌種，需要液氨保藏罐設備，且液氯來源有限，費用高，所以還不能普及推廣使用，只有少數科研院所使用。此外，還有冷凍真空干燥法，此法一般可保存10年以上，但成本較高。各菌種保藏中心、科研單位和生產單位可根據本地具體條件與生產實際選用菌種保藏方法，以確保菌種無退化或變異，保證科研、生產的正常進行。
3 菌種保藏效果的鑒定
食用菌菌種保藏效果的鑒定的常用指標是菌株的存活率和接種物成活率。我們認為要確切地判斷一個菌株在保藏后是否已發(fā)生了變異，僅測菌株的這2項指標是不夠的，還必須對其進行全面仔細的連續(xù)觀察和測定，可從以下4個方面進行考查：①生物學特征，如菌絲形態(tài)、顏色等；②對基質分解能力，如走菌、吃料速度等；③遺傳特征，如相關酶的酶譜、酶活力等；④生產出菇能力，包括產量、質量。通過經常檢驗，以確保不出現任何退化跡象的菌株取得菇農的信賴。再者，就菌種保藏本身而言，通過保藏菌種的效果鑒定，可以對保藏方法進行評價，進一步加以改善，使保藏體系更加完善。
4參考文獻
[1] 汪天鶴.《食用菌菌種管理辦法》及食用菌菌種種質資源保護生產、經營及質量管理與鑒定及貯藏實用手冊[M].北京：中國農業(yè)科學出版社，2006.
[2] 黃日明.食用菌育種栽培加工技術[M].長沙：湖南科學技術出版社，1998.
[3] 曾輝，王澤生.食用菌菌種保藏研究進展[J].中國食用菌，1994，13（5）：5-6
摘要 對食用菌菌種保藏的目的意義、基本原理、方法及效果鑒定進行了介紹，以便為廣大食用菌生產者的菌種保藏工作提供參考。
關鍵詞 食用菌；菌種保藏；斜面菌種；非斜面固體菌種
中圖分類號 S646.032 文獻標識碼A文章編號1007-5739（2008）18-0122-02
菌種是國家重要的生物資源，是生產、教學和科學研究的基本材料。食用菌和其他生物一樣，具有遺傳性和變異性，菌種保藏過程中，不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染，更主要的是保持菌種遺傳性狀不發(fā)生或盡可能少發(fā)生變異。一個優(yōu)良的食用菌菌種被選育出來以后，必須保持其優(yōu)良性狀不變或盡可能地少變慢變，才不至于降低生產性能，才能長期在生產中使用。因此，菌種保藏在食用菌生產上具有重要的意義。為適應群眾性生產的需要，使優(yōu)良高產菌株盡可能長時間地在生產上發(fā)揮作用，并降低菌種的衰亡速度，防止雜菌污染，確保菌種的純正，現對食用菌菌種的保藏做一簡介，并介紹幾種簡單易行、實用效果好的菌種保藏方法。
1 食用菌菌種保藏的目的意義及基本原理
菌種保藏的主要目的在于能在較長時間內保持菌種的生存，保持菌種在遺傳、形態(tài)和生理上的穩(wěn)定性。對于生產用的商業(yè)品種，就是要保持其生產性狀的穩(wěn)定性。同時，還要保持菌種的物種獨立性，即使其免受其他微生物的侵染，保持純培養(yǎng)狀態(tài)。因此，它與新品種的選育具有同等的重要性。特別是在目前國內菌種分散生產的情況下，菌種來源不清，菇農之間菌種誤傳，某些菇農和科研單位毫無根據地命名，使菌種出現同名異物或同物異名的現象，造成了菇農選擇菌種的困難。而菌種的保藏和管理有利于這些問題的緩解。
菌種保藏的方法很多，但原理大同小異，均是通過低溫、干燥、缺氧和饑餓等手段來達到最大限度降低菌絲體的生理代謝。首先要挑選優(yōu)良純菌種，包括菌絲體和它們的孢子；其次，根據其生理、生化特點，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的性狀，防止變異。不管采用哪種保藏方法，在菌種保存過程中要求不死亡、不污染雜菌和不退化。
2 食用菌菌種保藏的方法
2.1 試管斜面菌種系列保存方法
2.1.1 低溫定期移植保藏法。將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)，當菌絲健壯地長滿斜面時取出，放在3~5℃低溫干燥處或4℃冰箱中保藏，每隔3~6個月移植轉管1次，具體應根據菌種特性決定。保藏時要注意環(huán)境濕度不能太高，以防霉菌通過棉塞進入管內。因此，若用棉塞，可用干凈的塑料薄膜或牛皮紙包扎棉塞，也可用無菌的白膠塞，并用石蠟涂封，即可減少污染的機會，也可防止培養(yǎng)基干燥。除草菇外，大多食用菌菌種都能采用此法保藏。
2.1.2 液體石蠟保藏法。取化學純液體石蠟裝于三角瓶中高壓滅菌后，放入40℃恒溫箱中，蒸發(fā)其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上，28～30℃下培養(yǎng)2～3d，證明無雜菌生長方可使用。然后將母種接在斜面培養(yǎng)基上，當菌絲在斜面上生長豐滿后，將液體石蠟注在斜面上，注入量以高出斜面1cm為宜，使菌種與空氣隔絕，降低其新陳代謝能力。管口用滅過菌的白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，直立放在室內干燥處或冰箱內保藏。一般可保存1年以上，在低溫下保藏時間還可延長。使用時從斜面上挑取菌絲少許，移接到新鮮斜面培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)即可。由于菌絲體沾有液體石蠟而影響其生長，需再經1次移接才能恢復正常生長。
2.1.3 白膠塞封口保存法。選擇與試管口徑相符的白膠塞，用0.2%煤酚皂溶液洗滌，浸泡在酒精內待用。當試管斜面長滿菌絲后，在無菌條件下拔去棉塞，取浸泡的白膠塞1個，通過火焰迅速塞入試管口內，并用石蠟熔封。此法能達到與石蠟油封存相似的效果。用該法保存菌種可存活1～3年，但以每年移植1次為好。
2.1.4 蒸餾水保藏法。將8成熟試管菌種放在接種箱內，注入蒸餾水，將培養(yǎng)基斜面全部淹沒至管口2cm。管口用白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，常溫下置于陰涼處立放，可以保藏1年左右。
2.2 非斜面固體菌種系列保存法
2.2.1 麥麩保藏法。將麥麩和水按0.80∶1充分拌勻后，裝入試管高壓滅菌，經無菌檢查合格后接種，適溫下培養(yǎng)至菌絲體發(fā)育好后，將試管放入真空干燥器內，用真空泵將麥麩培養(yǎng)基內水分抽干，然后移入盛有硅膠的干燥器內，用凡士林密封在常溫下保存，可保藏3～5年。
2.2.2 麥粒保藏法。取優(yōu)質小麥，淘洗后浸入20℃水中5h，撈出稍晾干，裝入試管，占管深1/3，高壓滅菌后趁熱搖散，冷卻后接入菌絲體，適溫培養(yǎng)至菌絲長滿基質后用石蠟封棉塞，置于冰箱或20℃以下干燥處，可保藏1～2年。
2.2.3 木屑保藏法。將闊葉樹木屑78％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏粉1％，混合后加水拌勻，裝入試管滅菌后，接入斜面菌種，在適溫下培養(yǎng)，待菌絲長至試管2/3時用石蠟封棉塞，置低溫或常溫下保藏，一般可保藏1~ 2年。
2.2.4 稻草粉保存草菇菌種。草菇斜面菌種在2～4℃下保存2d便失去生活力，室溫下保存又因斜面培養(yǎng)基失水太快影響菌種存活。用稻草粉保存草菇菌種有其獨特的優(yōu)越性。其配方為稻草粉75%、麥麩22%、石膏粉1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%、適量的水拌勻調濕。裝入試管高壓滅菌后按常規(guī)接種培養(yǎng)，當菌絲長到試管2/3時，管口棉塞用石蠟熔封。常溫下保存至次年，不影響其活力和種性。
2.3 液體系列菌種保存法
2.3.1 生理鹽水保藏法。將待保藏的菌種接入馬鈴薯培養(yǎng)液中，在250mL三角形瓶中裝60mL培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)或每天搖動5～10次，培養(yǎng)5～7d，然后將形成的菌絲球用無菌吸管吸入裝有５mL無菌生理鹽水試管中，每管移入4～5個菌絲球，塞上無菌白膠塞，用石蠟涂封，置低溫下可保藏1～2年。
2.3.2 營養(yǎng)液保存法。營養(yǎng)液的配方為馬鈴薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、硫酸銨微量。每支試管內裝5mL，滅菌后用無菌吸管吸取生理鹽水保藏法深層培養(yǎng)的菌絲球4～5個于試管中，10~25℃的室溫下保存，可存活2～3年，其保存效果優(yōu)于生理鹽水保存法。不影響菌株形成子實體的能力。
2.3.3 無菌水保存法。先將培養(yǎng)好的斜面菌種切成小塊，連同培養(yǎng)基移入盛有適量無菌蒸餾水的試管中，然后用白膠塞封口，在20℃左右的室溫下保存?？纱婊?～2年。也可用磷酸緩沖液做保存液，其緩沖液的pH值視各保存菌株生長的酸堿度而定。該法操作簡便易行。
2.4 利用孢子保存菌種系列方法
2.4.1 濾紙片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）濾紙，剪成4.0cm×0.8cm的小紙條，平鋪在培養(yǎng)皿中用紙包裹進行滅菌。采用鉤懸法收集孢子，讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中，白膠塞封口，再將保藏試管放入干燥器中1～2d，除去濾紙水分，然后低溫保藏。保存期可達２～10年。
2.4.2 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗滌數次，過60目篩除去粗粒，加用1％稀鹽酸煮沸30min，以除去其中的有機質，再用水沖洗至pH值達到中性，烘干備用。同時取非耕作層的瘦黃土或紅土，用水反復沖洗至中性，烘干碾細，過100目篩，將處理好的沙與土以2～4∶1混勻，然后分裝小試管內，每管裝0.5g，高壓滅菌（1.5kg/cm2）3次，再干熱滅菌（160℃，2h）1次，待無菌檢驗合格后方可使用。將已形成孢子的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌水3mL，刮菌苔，制成菌懸液，再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內，接上真空泵抽氣至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48h內完成，以免孢子發(fā)芽。制備好的沙土管石蠟封口，在低溫下可保藏2～10年。
此外，還有甘油保藏法、枝條保藏法、超低溫液氮保藏法、冷凍真空干燥法等。
菌種保藏方法雖多，但都存在一些缺點，需進一步進行研究和探討。其中低溫定期移植保藏法雖然簡單易行，不需特殊設備，但需幾個月轉管1次，轉管的次數多了，變異的可能性就增大，易造成菌種衰退。近年來人們找到了一種目前認為最有效廣譜安全的保藏方法——超低溫液氮保藏法，在ATCC 用這種方法保藏雙孢蘑菇，9年后菌種仍保持穩(wěn)定，用于生產，產量、質量無大變化，是目前國際上公認為較為理想的菌種保藏方法，但用這種方法保藏菌種，需要液氨保藏罐設備，且液氯來源有限，費用高，所以還不能普及推廣使用，只有少數科研院所使用。此外，還有冷凍真空干燥法，此法一般可保存10年以上，但成本較高。各菌種保藏中心、科研單位和生產單位可根據本地具體條件與生產實際選用菌種保藏方法，以確保菌種無退化或變異，保證科研、生產的正常進行。
3 菌種保藏效果的鑒定
食用菌菌種保藏效果的鑒定的常用指標是菌株的存活率和接種物成活率。我們認為要確切地判斷一個菌株在保藏后是否已發(fā)生了變異，僅測菌株的這2項指標是不夠的，還必須對其進行全面仔細的連續(xù)觀察和測定，可從以下4個方面進行考查：①生物學特征，如菌絲形態(tài)、顏色等；②對基質分解能力，如走菌、吃料速度等；③遺傳特征，如相關酶的酶譜、酶活力等；④生產出菇能力，包括產量、質量。通過經常檢驗，以確保不出現任何退化跡象的菌株取得菇農的信賴。再者，就菌種保藏本身而言，通過保藏菌種的效果鑒定，可以對保藏方法進行評價，進一步加以改善，使保藏體系更加完善。
4參考文獻
[1] 汪天鶴.《食用菌菌種管理辦法》及食用菌菌種種質資源保護生產、經營及質量管理與鑒定及貯藏實用手冊[M].北京：中國農業(yè)科學出版社，2006.
[2] 黃日明.食用菌育種栽培加工技術[M].長沙：湖南科學技術出版社，1998.
[3] 曾輝，王澤生.食用菌菌種保藏研究進展[J].中國食用菌，1994，13（5）：5-6
