高產(chǎn)早熟香菇新品種選育實(shí)驗(yàn)報(bào)告
──原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌育種中的應(yīng)用研究之一
中國科學(xué)院北京農(nóng)村經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)部 梁枝榮
摘要 栽培用香菇菌株原生質(zhì)體經(jīng)UV處理后，進(jìn)行再生培養(yǎng)選育，篩選出了產(chǎn)量高、出菇早的香菇新品種。
關(guān)鍵詞 香菇 原生質(zhì)體 UV處理 出菇試驗(yàn)
食用蘑菇菌絲多核、擔(dān)孢子壁厚的特點(diǎn)造成誘變育種的困難。通過菌絲原生質(zhì)體的分離可以將菌絲中的細(xì)胞核分離成單個(gè)的體細(xì)胞，發(fā)育成新的菌株。脫壁后的原生質(zhì)體對誘變因子的敏感性增強(qiáng)，增加了變異的機(jī)會(huì)，提高了誘變率。根據(jù)這個(gè)原理，我們進(jìn)行了香菇菌絲原生質(zhì)體的紫外線誘變育種研究，現(xiàn)將初步結(jié)果整理總結(jié)如下，供同行參考。
I. 材料和方法
1.1 菌株：Ｌ３８， Ｌ１３，生產(chǎn)中栽培用菌株
1.2. 培養(yǎng)基：見表１
表１ 本實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基和化學(xué)試劑
──────────────────────────────────────
名稱* 組成成分(克/1000毫升)
──────────────────────────────────────
完全培養(yǎng)液(CM)： 硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.46， 磷酸氫二鉀1.0，蛋白胨2.0，酵母浸汁2.0， 葡萄糖20.0
完全固體培養(yǎng)基(CMA)： CM加20.0克瓊脂
高滲穩(wěn)定完全培養(yǎng)液(OCM)：CM加0.6克分子量的硫酸鎂
高滲穩(wěn)定液(OSS)： 0.6克分子量硫酸鎂, 0.05克分子量馬來酸, 酸堿度5.8
裂解酶液(ES)： 1.5%裂解酶溶于OSS
──────────────────────────────────────
1.3. 栽培袋培養(yǎng)料：木屑６５％，夫皮２０％，茶葉渣１５％，料水比1:1.6，拌勻裝入直徑１５X３０厘米的聚丙烯袋，每袋裝濕料６５０克，高壓滅菌。
1.4. 原生質(zhì)體分離
完全培養(yǎng)液內(nèi)２５度搖床培養(yǎng)７天的香菇菌絲體，用高滲穩(wěn)定液多次沖洗后加入酶液，２５度裂解５小時(shí)，玻璃纖維過瀘，瀘液離心收集原生質(zhì)體，用高滲穩(wěn)定液沖洗兩次。
1.5. 原生質(zhì)體誘變和雙核再生體的檢出
原生質(zhì)體稀釋液在黑暗中用紫外線燈以７.５爾格的劑量分別處理０秒、１０秒、１５秒、２０秒和３０秒。處理后的原生質(zhì)體溶液均勻涂抹于完全高滲培養(yǎng)基平板。黑暗中２５度培養(yǎng)再生１０－１５天，將單個(gè)再生菌落轉(zhuǎn)接到CMA平板，２５度培養(yǎng)５天后，通過顯微鏡觀察檢出雙核再生體。
1.6. 菌絲生長和出菇試驗(yàn)
從再生菌株和親本菌株菌落上切取直徑0.3厘米的小園片分別轉(zhuǎn)接入CMA平板中心，每個(gè)菌株做５次重復(fù)，24度暗光培養(yǎng)，定期觀察，于第21天測量菌落直徑。
再生菌株和親本菌株分別接入栽培袋，每個(gè)菌株做５次重復(fù)，暗光下２４度培養(yǎng)，定期觀察，于第５５天測量記載菌絲從袋口接種處到菌絲生長前沿長度。６０天菌絲滿袋，脫袋噴水２０度進(jìn)行轉(zhuǎn)色出菇培養(yǎng)?，F(xiàn)蕾后進(jìn)行出菇管理，子實(shí)體成熟后噴水前采菇稱重，記載統(tǒng)計(jì)三潮菇的產(chǎn)量。
II. 結(jié)果和討論
2.1 原生質(zhì)體分離和再生
采用本實(shí)驗(yàn)所用的原生質(zhì)體分離再生方法，一般可得到５Ｘ１０6擔(dān)ml以上的原生質(zhì)體，再生率在0.3-0.8%之間，原生質(zhì)體量和再生率可完全滿足實(shí)驗(yàn)所需。
2.2. 雙核菌絲的檢出
再生菌落經(jīng)顯微鏡觀察，約有１０％左右是單核菌絲，從單個(gè)再生菌落中挑選雙核菌絲體轉(zhuǎn)接入CMA平板，培養(yǎng)成再生菌株，做進(jìn)一步的研究。
2.3 再生菌株和親本菌株菌絲的生長
如表２所示，２５度培養(yǎng)２１天CMA平板培養(yǎng)基上菌落直徑在2.9-4.6厘米之間， 大部分分布在3.6-4.0厘米之間，其中生長最快的是L38-2， 直徑達(dá)到4.6厘米， 生長最慢的是L38-34和L38-55，直徑分別是3.0和2.9厘米；兩株親本菌株的直徑是3.8厘米。 栽培袋內(nèi)菌絲長度大部分在11.3 和12.2厘米左右， 其中生長最快的是L38-37，菌絲長度達(dá)到13厘米， 最慢的是L38-2和L38-6， 菌絲長度分別是10.5和10.3厘米；兩株親本菌株菌絲長度分別是11.5和12.2厘米(表3)。兩種培養(yǎng)基上親本菌株的生長速率均處于中間范圍，結(jié)果表明通過原生質(zhì)體分離誘變得到的再生菌株之間菌絲生長特性有了明顯的分化變異。
表2 CMA平板培養(yǎng)基上再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌落直徑(CM) 直徑平均值(CM) ─────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
2.9-3.0 3.0 6 5.7
3.1-3.5 3.3 3 2.9
3.6-4.0 3.8 30 28.6 2
4.1-4.5 4.3 63 60
4.6 4.6 3 2.9
───────────────────────────────────────
表3 栽培袋內(nèi)再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
─────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌絲長度(CM) 平均值(CM) ────────────── ─────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
9.9 -10.5 10.2 6 5.7
10.6-11.2 10.9 15 14.3
11.3-11.9 11.6 48 45.7 1(L13)
12.0-12.6 12.5 30 28.6 1(L38)
12.7-13.3 13.0 6 5.7
───────────────────────────────────────
2.4. 再生菌株和親本菌株的出菇期與出菇產(chǎn)量
親本菌株的出菇期為44-50天，出菇期最短的６株再生菌株在30-36天之間，而有３株再生菌株出菇期最長為57-63天，兩株親本出菇期在44-50天之間，結(jié)果表明通過原生質(zhì)體分離誘變得到的再生菌株出菇期也出現(xiàn)了較大的分化變異（表4）。
如表5所示，親本菌株的產(chǎn)量在56-127克的范圍內(nèi)，再生菌株的產(chǎn)量變異幅度較大，其中有６株沒有出菇，而有６株的產(chǎn)量超過親本菌株１倍以上，兩株親本菌株的產(chǎn)量處于平均值略微偏低一點(diǎn)的水平，結(jié)果表明，通過原生質(zhì)體分離誘變可篩選得到產(chǎn)量大幅度提高的變異菌株。
表4 再生菌株和親本菌株的出菇期
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
出菇期(天)* 平均值(天) ───────────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
30-36 33 6 5.7
37-43 40 33 33.3
44-50 47 42 40.0 2
51-56 54 15 16.1
57-63 60 3 2.9
───────────────────────────────────────
* 出菇期表示從菌絲滿袋到80%以上的菌袋現(xiàn)蕾
表5 再生菌株和親本菌株出菇產(chǎn)量比較
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
產(chǎn)量(克) 平均值(克) ───────────── ────────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
0 0 6 5.7
10-55 32.5 21 20.0
56-101 78.5 18 17.1 1(L38)
102-147 124.5 21 20.0 1(L13)
146-193 168.5 21 20.0
194-239 214.5 12 11.4
240-285 262.5 6 5.7
───────────────────────────────────────
2.5. 再生菌株產(chǎn)量的穩(wěn)定性
選出兩株產(chǎn)量較高的再生菌株通過組織分離得到下一代，連續(xù)兩代經(jīng)重復(fù)栽培實(shí)驗(yàn)，其高產(chǎn)早熟的特性穩(wěn)定（表6）
表6 再生菌株后代與親本菌株產(chǎn)量出菇期比較
───────────────────────────────────────
產(chǎn)量(克) 出菇期(天)
實(shí)驗(yàn)菌株 ────────────── ─────────────
第一 第二代 第三代 第一代 第二代 第三代
───────────────────────────────────────
親本菌株 L13 110 128 124 46 44 48
再生菌株 L13-4 222 267 249 31 35 32
再生菌株 L13-8 185 241 237 33 30 31
───────────────────────────────────────
III. 小結(jié)
本實(shí)驗(yàn)的目的就是以香菇為材料，探討通過原生質(zhì)體的分離誘變進(jìn)行食用菌菌種選育的可能性。香菇菌絲原生質(zhì)體通過不同劑量紫外線的處理，選出了１０５株再生菌株，這些菌株的菌絲生長特性、出菇量、出菇期與它們的原始菌株進(jìn)行了比較，一些再生菌株獲得了高產(chǎn)早熟的優(yōu)良特性。選出的幾株優(yōu)良菌株經(jīng)過多次繼代栽培，所獲得的優(yōu)良特性表現(xiàn)穩(wěn)定。結(jié)果表明，原生質(zhì)體分離誘變是一種很有應(yīng)用價(jià)值的食用菌菌種選育方法。（原文地址：http://mycologist.blog.163.com/blog/static/103586098201031201825229/）
──原生質(zhì)體技術(shù)在食用菌育種中的應(yīng)用研究之一
中國科學(xué)院北京農(nóng)村經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)部 梁枝榮
摘要 栽培用香菇菌株原生質(zhì)體經(jīng)UV處理后，進(jìn)行再生培養(yǎng)選育，篩選出了產(chǎn)量高、出菇早的香菇新品種。
關(guān)鍵詞 香菇 原生質(zhì)體 UV處理 出菇試驗(yàn)
食用蘑菇菌絲多核、擔(dān)孢子壁厚的特點(diǎn)造成誘變育種的困難。通過菌絲原生質(zhì)體的分離可以將菌絲中的細(xì)胞核分離成單個(gè)的體細(xì)胞，發(fā)育成新的菌株。脫壁后的原生質(zhì)體對誘變因子的敏感性增強(qiáng)，增加了變異的機(jī)會(huì)，提高了誘變率。根據(jù)這個(gè)原理，我們進(jìn)行了香菇菌絲原生質(zhì)體的紫外線誘變育種研究，現(xiàn)將初步結(jié)果整理總結(jié)如下，供同行參考。
I. 材料和方法
1.1 菌株：Ｌ３８， Ｌ１３，生產(chǎn)中栽培用菌株
1.2. 培養(yǎng)基：見表１
表１ 本實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基和化學(xué)試劑
──────────────────────────────────────
名稱* 組成成分(克/1000毫升)
──────────────────────────────────────
完全培養(yǎng)液(CM)： 硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.46， 磷酸氫二鉀1.0，蛋白胨2.0，酵母浸汁2.0， 葡萄糖20.0
完全固體培養(yǎng)基(CMA)： CM加20.0克瓊脂
高滲穩(wěn)定完全培養(yǎng)液(OCM)：CM加0.6克分子量的硫酸鎂
高滲穩(wěn)定液(OSS)： 0.6克分子量硫酸鎂, 0.05克分子量馬來酸, 酸堿度5.8
裂解酶液(ES)： 1.5%裂解酶溶于OSS
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1.3. 栽培袋培養(yǎng)料：木屑６５％，夫皮２０％，茶葉渣１５％，料水比1:1.6，拌勻裝入直徑１５X３０厘米的聚丙烯袋，每袋裝濕料６５０克，高壓滅菌。
1.4. 原生質(zhì)體分離
完全培養(yǎng)液內(nèi)２５度搖床培養(yǎng)７天的香菇菌絲體，用高滲穩(wěn)定液多次沖洗后加入酶液，２５度裂解５小時(shí)，玻璃纖維過瀘，瀘液離心收集原生質(zhì)體，用高滲穩(wěn)定液沖洗兩次。
1.5. 原生質(zhì)體誘變和雙核再生體的檢出
原生質(zhì)體稀釋液在黑暗中用紫外線燈以７.５爾格的劑量分別處理０秒、１０秒、１５秒、２０秒和３０秒。處理后的原生質(zhì)體溶液均勻涂抹于完全高滲培養(yǎng)基平板。黑暗中２５度培養(yǎng)再生１０－１５天，將單個(gè)再生菌落轉(zhuǎn)接到CMA平板，２５度培養(yǎng)５天后，通過顯微鏡觀察檢出雙核再生體。
1.6. 菌絲生長和出菇試驗(yàn)
從再生菌株和親本菌株菌落上切取直徑0.3厘米的小園片分別轉(zhuǎn)接入CMA平板中心，每個(gè)菌株做５次重復(fù)，24度暗光培養(yǎng)，定期觀察，于第21天測量菌落直徑。
再生菌株和親本菌株分別接入栽培袋，每個(gè)菌株做５次重復(fù)，暗光下２４度培養(yǎng)，定期觀察，于第５５天測量記載菌絲從袋口接種處到菌絲生長前沿長度。６０天菌絲滿袋，脫袋噴水２０度進(jìn)行轉(zhuǎn)色出菇培養(yǎng)?，F(xiàn)蕾后進(jìn)行出菇管理，子實(shí)體成熟后噴水前采菇稱重，記載統(tǒng)計(jì)三潮菇的產(chǎn)量。
II. 結(jié)果和討論
2.1 原生質(zhì)體分離和再生
采用本實(shí)驗(yàn)所用的原生質(zhì)體分離再生方法，一般可得到５Ｘ１０6擔(dān)ml以上的原生質(zhì)體，再生率在0.3-0.8%之間，原生質(zhì)體量和再生率可完全滿足實(shí)驗(yàn)所需。
2.2. 雙核菌絲的檢出
再生菌落經(jīng)顯微鏡觀察，約有１０％左右是單核菌絲，從單個(gè)再生菌落中挑選雙核菌絲體轉(zhuǎn)接入CMA平板，培養(yǎng)成再生菌株，做進(jìn)一步的研究。
2.3 再生菌株和親本菌株菌絲的生長
如表２所示，２５度培養(yǎng)２１天CMA平板培養(yǎng)基上菌落直徑在2.9-4.6厘米之間， 大部分分布在3.6-4.0厘米之間，其中生長最快的是L38-2， 直徑達(dá)到4.6厘米， 生長最慢的是L38-34和L38-55，直徑分別是3.0和2.9厘米；兩株親本菌株的直徑是3.8厘米。 栽培袋內(nèi)菌絲長度大部分在11.3 和12.2厘米左右， 其中生長最快的是L38-37，菌絲長度達(dá)到13厘米， 最慢的是L38-2和L38-6， 菌絲長度分別是10.5和10.3厘米；兩株親本菌株菌絲長度分別是11.5和12.2厘米(表3)。兩種培養(yǎng)基上親本菌株的生長速率均處于中間范圍，結(jié)果表明通過原生質(zhì)體分離誘變得到的再生菌株之間菌絲生長特性有了明顯的分化變異。
表2 CMA平板培養(yǎng)基上再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌落直徑(CM) 直徑平均值(CM) ─────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
2.9-3.0 3.0 6 5.7
3.1-3.5 3.3 3 2.9
3.6-4.0 3.8 30 28.6 2
4.1-4.5 4.3 63 60
4.6 4.6 3 2.9
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表3 栽培袋內(nèi)再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
─────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌絲長度(CM) 平均值(CM) ────────────── ─────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
9.9 -10.5 10.2 6 5.7
10.6-11.2 10.9 15 14.3
11.3-11.9 11.6 48 45.7 1(L13)
12.0-12.6 12.5 30 28.6 1(L38)
12.7-13.3 13.0 6 5.7
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2.4. 再生菌株和親本菌株的出菇期與出菇產(chǎn)量
親本菌株的出菇期為44-50天，出菇期最短的６株再生菌株在30-36天之間，而有３株再生菌株出菇期最長為57-63天，兩株親本出菇期在44-50天之間，結(jié)果表明通過原生質(zhì)體分離誘變得到的再生菌株出菇期也出現(xiàn)了較大的分化變異（表4）。
如表5所示，親本菌株的產(chǎn)量在56-127克的范圍內(nèi)，再生菌株的產(chǎn)量變異幅度較大，其中有６株沒有出菇，而有６株的產(chǎn)量超過親本菌株１倍以上，兩株親本菌株的產(chǎn)量處于平均值略微偏低一點(diǎn)的水平，結(jié)果表明，通過原生質(zhì)體分離誘變可篩選得到產(chǎn)量大幅度提高的變異菌株。
表4 再生菌株和親本菌株的出菇期
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再生菌株 親本菌株
出菇期(天)* 平均值(天) ───────────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
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30-36 33 6 5.7
37-43 40 33 33.3
44-50 47 42 40.0 2
51-56 54 15 16.1
57-63 60 3 2.9
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* 出菇期表示從菌絲滿袋到80%以上的菌袋現(xiàn)蕾
表5 再生菌株和親本菌株出菇產(chǎn)量比較
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再生菌株 親本菌株
產(chǎn)量(克) 平均值(克) ───────────── ────────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
0 0 6 5.7
10-55 32.5 21 20.0
56-101 78.5 18 17.1 1(L38)
102-147 124.5 21 20.0 1(L13)
146-193 168.5 21 20.0
194-239 214.5 12 11.4
240-285 262.5 6 5.7
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2.5. 再生菌株產(chǎn)量的穩(wěn)定性
選出兩株產(chǎn)量較高的再生菌株通過組織分離得到下一代，連續(xù)兩代經(jīng)重復(fù)栽培實(shí)驗(yàn)，其高產(chǎn)早熟的特性穩(wěn)定（表6）
表6 再生菌株后代與親本菌株產(chǎn)量出菇期比較
───────────────────────────────────────
產(chǎn)量(克) 出菇期(天)
實(shí)驗(yàn)菌株 ────────────── ─────────────
第一 第二代 第三代 第一代 第二代 第三代
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親本菌株 L13 110 128 124 46 44 48
再生菌株 L13-4 222 267 249 31 35 32
再生菌株 L13-8 185 241 237 33 30 31
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III. 小結(jié)
本實(shí)驗(yàn)的目的就是以香菇為材料，探討通過原生質(zhì)體的分離誘變進(jìn)行食用菌菌種選育的可能性。香菇菌絲原生質(zhì)體通過不同劑量紫外線的處理，選出了１０５株再生菌株，這些菌株的菌絲生長特性、出菇量、出菇期與它們的原始菌株進(jìn)行了比較，一些再生菌株獲得了高產(chǎn)早熟的優(yōu)良特性。選出的幾株優(yōu)良菌株經(jīng)過多次繼代栽培，所獲得的優(yōu)良特性表現(xiàn)穩(wěn)定。結(jié)果表明，原生質(zhì)體分離誘變是一種很有應(yīng)用價(jià)值的食用菌菌種選育方法。（原文地址：http://mycologist.blog.163.com/blog/static/103586098201031201825229/）
