在食用菌菌種生產過程中，除了液體菌種和斜面培養(yǎng)基外，其他的二、三級種大部分都是用木屑、棉籽殼、稻草或小麥培養(yǎng)基。液體和斜面培養(yǎng)基一旦感染雜菌一般可用肉眼直接觀察發(fā)現(xiàn)，而木屑等培養(yǎng)基感染木霉、毛霉、青霉、黃曲霉、鏈孢霉等能用肉眼發(fā)現(xiàn)，一旦感染細菌、酵母菌等則不能用肉眼直接觀察發(fā)現(xiàn)，而只能通過顯微鏡或移接斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后才能檢出，故稱之為隱性污染。雖然發(fā)生此類污染比較少，但是由于其具有很大的隱蔽性，發(fā)現(xiàn)了也為時已晚。菌種批量生產時若不及時找出原因，對癥下藥，損失也是很大的。1999年初，筆者曾為此事困惑了一個多月，損失慘重。現(xiàn)將發(fā)生的癥狀。原因分析及其對策簡述如下。
1 木屑培養(yǎng)基發(fā)生隱性污染的癥狀
木屑培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻，接種香菇、靈芝、木耳等菌種后，分別于適溫條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)前10d一切正常，10d以后木耳和靈芝菌絲出現(xiàn)長速減慢，甚至停止生長；15d以后香菇菌絲也出現(xiàn)同樣現(xiàn)象。并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)室內溫度越高的地方，如：培養(yǎng)架中間幾層和每層的中部，發(fā)生的現(xiàn)象越嚴重。而仔細觀察培養(yǎng)料卻發(fā)現(xiàn)不了一丁點兒蛛絲馬跡的變化，既沒有木霉、青霉、根霉污染，也沒有曲霉、鏈抱霉和毛霉出現(xiàn)，可見不象是常見的真菌性病害；破袋聞料則又酸又臭；把培養(yǎng)袋放置在20±2℃下培養(yǎng)，則菌絲能繼續(xù)慢慢生長，直至發(fā)菌結束。然后再用此隱性污染菌種轉接到滅菌徹底的木屑培養(yǎng)基上，在20±2℃下培養(yǎng)則菌絲生長正常，沒有出現(xiàn)上述長速減慢或停滯生長現(xiàn)象。
另外，發(fā)現(xiàn)越新鮮的木屑發(fā)生隱性污染的概率越大，而堆積過或被雨淋過的木屑反而較少發(fā)生。
2 木屑培養(yǎng)基發(fā)生隱性污染的原因分析及對策
筆者制種10年來，木屑培養(yǎng)基的滅菌一直是采用高壓鍋1.470997 X100000pa的壓力保持1h，滅菌前關閉放汽閥，當鍋內壓力達4.903323 X10000pa時，緩慢打開放汽間排放冷空氣，當壓力降到零時，再關閉放汽閥，升壓至1.470997X100000pa，保持1h，然后退火降壓至4.903323X10000pa時再緩慢放汽至零，最后打開鍋門冷卻。筆者用此法在l998年之前在木屑培養(yǎng)基上從未發(fā)生過滅菌不徹底的現(xiàn)象。1999年初卻連續(xù)發(fā)生不同程度的隱性污染事件，經(jīng)過反復思考和不斷試驗，發(fā)現(xiàn)高壓鍋內的“假壓”現(xiàn)象是罪魁禍首，是最主要的原因。造成“假壓”現(xiàn)象的原因可分為以下兩個方面：
2.1 壓力表的壓力不精確 由于壓力表使用多年，連接壓力指針的彈簧失去原有的良好彈性，在鍋內沒有壓力時壓力指針也不能復位到零，只能回復到1.961330 X10000pa，如此在壓力達1.470997X100000pa時實際壓力才1.274865 x100000pa。筆者曾用溫度范圍為60－150℃，象體溫計一樣水銀柱不會自然下降的溫度計多次放在鍋內測量溫度，發(fā)現(xiàn)在1.470997X100000pa時，鍋內實際溫度只有123℃，在1.667131x100000pa時，溫度才達126℃，如此可見，當壓力表指針不能復位到零時，誤差多少就應該在保持壓力時人為增加多少，這樣才能真正保證鍋內的實際壓力，達到預期的滅菌目的。
2.2 高壓鍋內冷空氣未排放干凈，實際溫度沒有達到要求．造成培養(yǎng)基滅菌不徹底 水在常壓下100℃沸騰，壓力升高水的沸點也升高。高壓鍋內常用的壓力9.806650×10000pa－1．470997X100000pa（精確的壓力表讀數(shù)),鍋內溫度達到121－127℃，溫度高時，蒸汽穿透力強，可在較短時間內達到滅菌效果。但是鍋內如有冷空氣存在。蒸汽壓降低，鍋內溫度低于壓力表所示壓力的相對溫度，如：在壓力為1.274865X100000pa時，全部排除冷空氣溫度為 126℃，排除1／2為118℃，不排除則為109℃。另外，局部空氣阻留，使熱力難以穿透，形成低溫死角。因此，加熱滅菌時，排凈冷空氣顯得非常重要。根據(jù)排汽管或排汽口位置不同排除冷空氣的方法也不同。手提式高壓鍋由于排汽口在底部可采用加熱時先打開排汽閥，使冷空氣受蒸汽壓力外排，待排汽口有大量熱蒸汽外排時，再關閉排汽閥使之升壓至一定壓力保持一段時間，而比較大的高壓鍋排汽口一般都在頂部或中部，故加熱時先關閉排汽閥，待壓力升至4.903325XI0000pa時，逐漸開大閥門放汽，至壓力回復到零時關閉閥門，再加熱升壓。
此外，把發(fā)酸發(fā)臭的培養(yǎng)基轉接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)形成的菌落特征為光滑、濕潤、不透明奶油狀，菌落與培養(yǎng)基接合不緊，易被接種針挑起。鏡檢后確定為枯草芽孢桿菌。此菌芽孢是非常耐熱的，最不易滅菌徹底，它的最適生長溫度為37℃，所以培養(yǎng)室內溫度越高的地方，此菌生長越快，越容易發(fā)酸發(fā)臭。木耳、靈芝菌種因培養(yǎng)時溫度比香菇高3－5℃，故細菌更容易生長繁殖，從而抑制了菌絲的正常生長。
在日本，臺灣的一些食用菌栽培資料中，培養(yǎng)料中的木屑通常需要堆積一段時間甚至半年以上，并且與我們相比滅菌時間要短一些，這可能與堆積后的木屑更容易被滅菌徹底有關。本次試驗也發(fā)現(xiàn)新鮮木屑不易滅菌徹底，更易遭受隱性污染。
1 木屑培養(yǎng)基發(fā)生隱性污染的癥狀
木屑培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻，接種香菇、靈芝、木耳等菌種后，分別于適溫條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)前10d一切正常，10d以后木耳和靈芝菌絲出現(xiàn)長速減慢，甚至停止生長；15d以后香菇菌絲也出現(xiàn)同樣現(xiàn)象。并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)室內溫度越高的地方，如：培養(yǎng)架中間幾層和每層的中部，發(fā)生的現(xiàn)象越嚴重。而仔細觀察培養(yǎng)料卻發(fā)現(xiàn)不了一丁點兒蛛絲馬跡的變化，既沒有木霉、青霉、根霉污染，也沒有曲霉、鏈抱霉和毛霉出現(xiàn)，可見不象是常見的真菌性病害；破袋聞料則又酸又臭；把培養(yǎng)袋放置在20±2℃下培養(yǎng)，則菌絲能繼續(xù)慢慢生長，直至發(fā)菌結束。然后再用此隱性污染菌種轉接到滅菌徹底的木屑培養(yǎng)基上，在20±2℃下培養(yǎng)則菌絲生長正常，沒有出現(xiàn)上述長速減慢或停滯生長現(xiàn)象。
另外，發(fā)現(xiàn)越新鮮的木屑發(fā)生隱性污染的概率越大，而堆積過或被雨淋過的木屑反而較少發(fā)生。
2 木屑培養(yǎng)基發(fā)生隱性污染的原因分析及對策
筆者制種10年來，木屑培養(yǎng)基的滅菌一直是采用高壓鍋1.470997 X100000pa的壓力保持1h，滅菌前關閉放汽閥，當鍋內壓力達4.903323 X10000pa時，緩慢打開放汽間排放冷空氣，當壓力降到零時，再關閉放汽閥，升壓至1.470997X100000pa，保持1h，然后退火降壓至4.903323X10000pa時再緩慢放汽至零，最后打開鍋門冷卻。筆者用此法在l998年之前在木屑培養(yǎng)基上從未發(fā)生過滅菌不徹底的現(xiàn)象。1999年初卻連續(xù)發(fā)生不同程度的隱性污染事件，經(jīng)過反復思考和不斷試驗，發(fā)現(xiàn)高壓鍋內的“假壓”現(xiàn)象是罪魁禍首，是最主要的原因。造成“假壓”現(xiàn)象的原因可分為以下兩個方面：
2.1 壓力表的壓力不精確 由于壓力表使用多年，連接壓力指針的彈簧失去原有的良好彈性，在鍋內沒有壓力時壓力指針也不能復位到零，只能回復到1.961330 X10000pa，如此在壓力達1.470997X100000pa時實際壓力才1.274865 x100000pa。筆者曾用溫度范圍為60－150℃，象體溫計一樣水銀柱不會自然下降的溫度計多次放在鍋內測量溫度，發(fā)現(xiàn)在1.470997X100000pa時，鍋內實際溫度只有123℃，在1.667131x100000pa時，溫度才達126℃，如此可見，當壓力表指針不能復位到零時，誤差多少就應該在保持壓力時人為增加多少，這樣才能真正保證鍋內的實際壓力，達到預期的滅菌目的。
2.2 高壓鍋內冷空氣未排放干凈，實際溫度沒有達到要求．造成培養(yǎng)基滅菌不徹底 水在常壓下100℃沸騰，壓力升高水的沸點也升高。高壓鍋內常用的壓力9.806650×10000pa－1．470997X100000pa（精確的壓力表讀數(shù)),鍋內溫度達到121－127℃，溫度高時，蒸汽穿透力強，可在較短時間內達到滅菌效果。但是鍋內如有冷空氣存在。蒸汽壓降低，鍋內溫度低于壓力表所示壓力的相對溫度，如：在壓力為1.274865X100000pa時，全部排除冷空氣溫度為 126℃，排除1／2為118℃，不排除則為109℃。另外，局部空氣阻留，使熱力難以穿透，形成低溫死角。因此，加熱滅菌時，排凈冷空氣顯得非常重要。根據(jù)排汽管或排汽口位置不同排除冷空氣的方法也不同。手提式高壓鍋由于排汽口在底部可采用加熱時先打開排汽閥，使冷空氣受蒸汽壓力外排，待排汽口有大量熱蒸汽外排時，再關閉排汽閥使之升壓至一定壓力保持一段時間，而比較大的高壓鍋排汽口一般都在頂部或中部，故加熱時先關閉排汽閥，待壓力升至4.903325XI0000pa時，逐漸開大閥門放汽，至壓力回復到零時關閉閥門，再加熱升壓。
此外，把發(fā)酸發(fā)臭的培養(yǎng)基轉接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)形成的菌落特征為光滑、濕潤、不透明奶油狀，菌落與培養(yǎng)基接合不緊，易被接種針挑起。鏡檢后確定為枯草芽孢桿菌。此菌芽孢是非常耐熱的，最不易滅菌徹底，它的最適生長溫度為37℃，所以培養(yǎng)室內溫度越高的地方，此菌生長越快，越容易發(fā)酸發(fā)臭。木耳、靈芝菌種因培養(yǎng)時溫度比香菇高3－5℃，故細菌更容易生長繁殖，從而抑制了菌絲的正常生長。
在日本，臺灣的一些食用菌栽培資料中，培養(yǎng)料中的木屑通常需要堆積一段時間甚至半年以上，并且與我們相比滅菌時間要短一些，這可能與堆積后的木屑更容易被滅菌徹底有關。本次試驗也發(fā)現(xiàn)新鮮木屑不易滅菌徹底，更易遭受隱性污染。
