桑黃孔菌屬真菌（Sanghuangporus），俗稱桑黃，隸屬于擔(dān)子菌門、蘑菇綱、銹革孔菌目、銹革孔菌科，是在我國具有悠久應(yīng)用歷史的藥用大型真菌。目前，桑黃孔菌屬共有19個物種，其中11種在我國有分布。隨著我國桑黃產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，將與桑黃形態(tài)相近物種充當桑黃進行銷售的欺詐行為屢見不鮮，擾亂了桑黃產(chǎn)業(yè)的市場秩序。更為嚴峻的是，由于韓國、日本、泰國等大中華文化圈國家對桑黃的高度認可，我國的桑黃資源面臨一定程度的流失風(fēng)險。因此，急需開發(fā)一種可以針對桑黃孔菌屬真菌進行快速檢測的方法，以保護桑黃這一重要戰(zhàn)略生物資源的安全，促進桑黃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
本研究首先將桑黃孔菌屬，以及Fuscoporia、Inonotus、Phellinus、Tropicoporus等形態(tài)近似屬的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS）進行比對，并在ITS1區(qū)域設(shè)計了桑黃孔菌屬的特異性引物和探針（圖1）。隨后選取我國的11個桑黃物種、及12個形態(tài)和分類關(guān)系與桑黃相近的物種，進行引物和探針特異性驗證。經(jīng)驗證，在第35個循環(huán)周期前，11個桑黃物種均出現(xiàn)擴增曲線，12個近緣種和空白對照均無擴增曲線，表明特異性引物和探針可有效檢測我國桑黃物種（圖2）。
圖1：我國桑黃孔菌屬真菌特異性引物和探針在ITS1區(qū)域的位置（紅框表示正向引物S-F和反向引物S-R的位置，綠框表示探針的位置，深藍色區(qū)域代表在我國桑黃孔菌屬所有物種中的一致序列）。
圖2：基于qPCR的特異性引物和探針在檢測我國11個桑黃物種的特異性表現(xiàn)。
進一步選用在桑黃產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用最廣泛的三個物種，即鮑姆桑黃（S.baumii）、桑樹桑黃（S. sanghuang）和楊樹桑黃（S.vaninii），優(yōu)化特異性引物和探針的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特異性引物和探針的濃度越高，Ct值越低，熒光強度越強。綜合考量特異性引物和探針的合成成本，在20 μL的qPCR體系中，將0.7 μmol/L作為引物的最佳工作濃度，0.5 μmol/L作為探針的最佳工作濃度（圖3）。使用最佳工作濃度的特異性引物和探針，重新對qPCR的擴增特異性進行了評估。發(fā)現(xiàn)最佳工作濃度的特異性引物和探針在檢測我國桑黃物種中仍表現(xiàn)良好。尤其值得注意的是，最佳工作濃度下的特異性引物和探針可在更短的qPCR循環(huán)周期內(nèi)特異性檢測出我國的桑黃物種（圖4）。
圖3：桑黃孔菌屬真菌特異性引物和探針濃度優(yōu)化。（A）引物在不同工作濃度下的循環(huán)閾值,（B）引物在不同工作濃度下的相對熒光單位,（C）探針在不同工作濃度下的循環(huán)閾值,（D）探針在不同工作濃度下的相對熒光單位。
圖4：基于qPCR的特異性引物和探針在最佳濃度下檢測我國11個桑黃物種的特異性表現(xiàn)。
同樣選擇S.baumii、S.sanghuang和S.vaninii，測定基于qPCR快速檢測反應(yīng)的靈敏度。分別將三個物種的DNA濃度進行梯度稀釋，即10 ng/μL、1 ng/μL、10-1 ng/μL、10-2 ng/μL、10-3 ng/μL、10-4 ng/μL、10-5 ng/μL和10-6 ng/μL，分別采用濃度優(yōu)化前后的引物和探針進行靈敏度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳濃度引物和探針的靈敏度相較優(yōu)化前有所提高，其最低檢出限的DNA模板濃度為10-3ng/μL（圖5）。
圖5：基于qPCR的我國桑黃孔菌屬真菌快速檢測方法的靈敏度。（A、B、C）原始濃度特異性引物和探針的靈敏度，（D、E、F）最佳濃度特異性引物和探針的靈敏度（編號1-3表示DNA模板濃度為10 ng/μL、4-6為1ng/μL、7-9為10-1ng/μL、10-12為10-2ng/μL、13-15為10-3ng/μL）。
綜上，本研究基于qPCR技術(shù)首次開發(fā)了快速檢測我國桑黃孔菌屬真菌的方法，相關(guān)研究結(jié)果已申請專利一項（已受理），并于2024年10月20日，以Development and optimization of the qPCR-based rapid detection method for Chinese species of Sanghuangporus為題，在線發(fā)表于LWT-Food Science and Technology期刊。中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室與遼寧大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生趙靜為本文第一作者，周麗偉研究員為通訊作者，博士研究生王雪蔚、助理研究員姜霽航和副研究員劉世良也參與了研究工作。感謝北京林業(yè)大學(xué)戴玉成教授、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)圖力古爾教授、臺中自然博物館吳聲華研究員、中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所魏玉蓮博士提供的桑黃樣品，感謝中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室李善魁同學(xué)、趙鵬副研究員在研究過程中給予的幫助！本研究得到國家重點研發(fā)計劃（No. 2022YFC2601200）的資助。
全文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643824012064
